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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸PCR
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dxli1988

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸PCR

最近一直在做重叠延伸PCR,获得第一轮的产物，切胶回收后，在第二轮重叠PCR怎么也做不出来，个人觉得引物没有问题，重叠22bp，本身基因的GC比就不太正常，含量较低，但引物再重新设计的可能性不大，希望各位前辈指点一二。引物序列分别为：
AF: TTAGTTCGGTAGTTGAGGG
AR:  ATAACGTTCATTACTTCTCCAGATTTTGTGTCATTC
BF: CTGGAGAAGTAATGAACGTTATTGCAATATTGAATC
BR: TAGCAGTTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG
A基因片段长为535bp，B片段长为2168bp。
前5个循环不加引物，低温退后，加引物后25循环。这是其中一次梯度PCR的结果。

重叠延伸PCR结果
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逆水行舟，不进则退。
1楼 2012-08-26 18:00:14
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 回帖置顶 2012-08-26 20:41:25
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-26 20:41:30
dxli1988: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-26 21:52:37
我现在也在做这类实验。刚刚无结果，原先的时候和你一样，都不能扩出目的片段，只能得到其中的一条片段。不过后来，我请教些前辈，就做出来了。他们建议我从重叠的片段质量入手，所谓片段质量指的是你加如反应体系的两片段的摩尔比要是1：1，就拿你的片段来说，如果两片段的浓度基本一样，那么二者的体积比就要是4：1（大：小）；再者就是前五个循环里的延伸时间要足够，退火温度要合适！实在确定不了，就用Touch-down吧！若还是出不来，尝试下把循环数增加几个！
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4楼2012-08-26 19:24:59
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by piaoyunokok at 2012-08-27 11:24:17
恩啊，最近我也在做这个，两个片段大小不同的话，浓度基本一样，体积比应该是片段小的添加量小吗？...

是的。如果浓度一样，那二者就是片段大小的反比。如1000bp的片段和500bp的片段，二者体积比就是2:1，就是要保证二者的条数一样！
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15楼2012-08-27 21:04:25
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tuodecai

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-27 13:49:17
dxli1988: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-27 15:44:41
从技术上来讲，这不是难题，凭我多年overlapping PCR的经验，我拼接过两个5k的片段成11k的。给你点信心！呵呵   我建议重叠区最好稍长一点 25-30bp，意思就是让重叠区的退火温度高一点，而引物的Tm值稍低一点。套叠PCR最关键的是模板了，一是要纯，二是浓度稍高（最好能达到100-200ng/lu）。其次，改进PCR反应条件也会有一定的作用，我常用的是在第一轮在一较高的温度退火后，72度延伸10min。想当初我跟你一样，曾经发过很多贴求助套叠PCR，也看过很多贴，实验技能这东西还是要不断的失败中积累经验。祝你早日成功！
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9楼2012-08-27 10:32:42
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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dxli1988: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-08-26 22:12:44
引用回帖:
5楼: Originally posted by dxli1988 at 2012-08-26 21:54:33
延伸时间足够是怎么回事，我在前5个循环里延伸5s，因为只有22bp重合，这样可以吗，还有touchdown我也做过，到底是个逐渐升温的过程还是降温的过程呢？...

延伸时间5s怎么够？前5个循环的作用是什么要搞清楚，延伸是为了得到连接后的总长度啊，也就是要扩2700左右的片段，好歹也得2-3min啊，后面加引物就是以这段全长为模板进行PCR扩增的。以后再做SOE的时候，一定要保证重合在30bp个以上，这样就很好做了！
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7楼2012-08-26 22:02:41
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dxli1988

金虫 (小有名气)
电泳图中，前4个孔不是，后边的全是。
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2楼2012-08-26 18:01:05
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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dxli1988: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-08-26 21:52:46
胶回收后，再做第二轮PCR的前五个反应可以适当延伸一下时间，就是延伸时间变长一些，而且第二轮PCR的退火温度适当再降低一些，延伸时间3min左右吧，我以前经常做重叠PCR，从来没有出现过其他问题，不过我的片段总长在2000bp左右。希望对你有些帮助。
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3楼2012-08-26 19:02:13
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dxli1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chjinzhi at 2012-08-26 19:24:59
我现在也在做这类实验。刚刚无结果，原先的时候和你一样，都不能扩出目的片段，只能得到其中的一条片段。不过后来，我请教些前辈，就做出来了。他们建议我从重叠的片段质量入手，所谓片段质量指的是你加如反应体系的 ...

延伸时间足够是怎么回事，我在前5个循环里延伸5s，因为只有22bp重合，这样可以吗，还有touchdown我也做过，到底是个逐渐升温的过程还是降温的过程呢？
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5楼2012-08-26 21:54:33
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dxli1988

金虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by lishaohe at 2012-08-26 19:02:13
胶回收后，再做第二轮PCR的前五个反应可以适当延伸一下时间，就是延伸时间变长一些，而且第二轮PCR的退火温度适当再降低一些，延伸时间3min左右吧，我以前经常做重叠PCR，从来没有出现过其他问题，不过我的片段总长 ...

前五个反应的延伸时间怎么算呢？退火温度也做了梯度，也没接过，我用的pfu,延伸速率为500bp/min，我设置的延伸时间为5min，
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逆水行舟，不进则退。
6楼2012-08-26 22:01:44
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dxli1988

金虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-26 22:02:41
延伸时间5s怎么够？前5个循环的作用是什么要搞清楚，延伸是为了得到连接后的总长度啊，也就是要扩2700左右的片段，好歹也得2-3min啊，后面加引物就是以这段全长为模板进行PCR扩增的。以后再做SOE的时候，一定要保证 ...

我的理解是，前5个反应只是负责搭桥，这一部分只有重叠的部分反应，和全长有直接的关系吗？还有这个退火温度是不是按照重叠部分的Tm值来参考呢？
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8楼2012-08-26 22:15:30
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chjinzhi at 2012-08-26 19:24:59
我现在也在做这类实验。刚刚无结果，原先的时候和你一样，都不能扩出目的片段，只能得到其中的一条片段。不过后来，我请教些前辈，就做出来了。他们建议我从重叠的片段质量入手，所谓片段质量指的是你加如反应体系的 ...

恩啊，最近我也在做这个，两个片段大小不同的话，浓度基本一样，体积比应该是片段小的添加量小吗？
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10楼2012-08-27 11:24:17
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