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重叠延伸PCR
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最近一直在做重叠延伸PCR,获得第一轮的产物，切胶回收后，在第二轮重叠PCR怎么也做不出来，个人觉得引物没有问题，重叠22bp，本身基因的GC比就不太正常，含量较低，但引物再重新设计的可能性不大，希望各位前辈指点一二。引物序列分别为： AF: TTAGTTCGGTAGTTGAGGG AR: ATAACGTTCATTACTTCTCCAGATTTTGTGTCATTC BF: CTGGAGAAGTAATGAACGTTATTGCAATATTGAATC BR: TAGCAGTTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG A基因片段长为535bp，B片段长为2168bp。 前5个循环不加引物，低温退后，加引物后25循环。这是其中一次梯度PCR的结果。  重叠延伸PCR结果 |
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散金
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tuodecai
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【答案】应助回帖
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dxli1988: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-27 15:44:41
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dxli1988: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-08-27 15:44:41
 从技术上来讲，这不是难题，凭我多年overlapping PCR的经验，我拼接过两个5k的片段成11k的。给你点信心！呵呵 我建议重叠区最好稍长一点 25-30bp，意思就是让重叠区的退火温度高一点，而引物的Tm值稍低一点。套叠PCR最关键的是模板了，一是要纯，二是浓度稍高（最好能达到100-200ng/lu）。其次，改进PCR反应条件也会有一定的作用，我常用的是在第一轮在一较高的温度退火后，72度延伸10min。想当初我跟你一样，曾经发过很多贴求助套叠PCR，也看过很多贴，实验技能这东西还是要不断的失败中积累经验。祝你早日成功！ |
9楼2012-08-27 10:32:42
2楼2012-08-26 18:01:05
lishaohe 
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| 我现在也在做这类实验。刚刚无结果，原先的时候和你一样，都不能扩出目的片段，只能得到其中的一条片段。不过后来，我请教些前辈，就做出来了。他们建议我从重叠的片段质量入手，所谓片段质量指的是你加如反应体系的两片段的摩尔比要是1：1，就拿你的片段来说，如果两片段的浓度基本一样，那么二者的体积比就要是4：1（大：小）；再者就是前五个循环里的延伸时间要足够，退火温度要合适！实在确定不了，就用Touch-down吧！若还是出不来，尝试下把循环数增加几个！ |
4楼2012-08-26 19:24:59
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