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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸PCR
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dxli1988: 金币+13, ★★★很有帮助 2012-08-27 15:28:35
建议用回收产物做模版，直接用touchdown 升温程序，再控制一下延伸时间！
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持之以恒、永不放弃！
11楼2012-08-27 12:51:59
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by dxli1988 at 2012-08-26 22:15:30
我的理解是，前5个反应只是负责搭桥，这一部分只有重叠的部分反应，和全长有直接的关系吗？还有这个退火温度是不是按照重叠部分的Tm值来参考呢？...

搭桥的话是在退火的时候就搭上了，而只是两个互补区连接起来。然后延伸时就可以把整个片段都给P出来，这样就可以作为下一步反应的模板了。
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12楼2012-08-27 13:39:08
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dxli1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-27 13:39:08
搭桥的话是在退火的时候就搭上了，而只是两个互补区连接起来。然后延伸时就可以把整个片段都给P出来，这样就可以作为下一步反应的模板了。...

恩，谢谢
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逆水行舟，不进则退。
13楼2012-08-27 15:28:27
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dxli1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tuodecai at 2012-08-27 10:32:42
从技术上来讲，这不是难题，凭我多年overlapping PCR的经验，我拼接过两个5k的片段成11k的。给你点信心！呵呵   我建议重叠区最好稍长一点 25-30bp，意思就是让重叠区的退火温度高一点，而引物的Tm值稍低一点 ...

是前辈啊，呵呵，“我常用的是在第一轮在一较高的温度退火后，72度延伸10min。”这句话是什么意思呢？做了很久，也有不少人给建议，就是没做出来，
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逆水行舟，不进则退。
14楼2012-08-27 15:46:48
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by piaoyunokok at 2012-08-27 11:24:17
恩啊，最近我也在做这个，两个片段大小不同的话，浓度基本一样，体积比应该是片段小的添加量小吗？...

是的。如果浓度一样，那二者就是片段大小的反比。如1000bp的片段和500bp的片段，二者体积比就是2:1，就是要保证二者的条数一样！
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15楼2012-08-27 21:04:25
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dxli1988: 金币+2, ★★★很有帮助, 你的回答挺形象的，谢谢 2012-08-27 22:14:53
小丹木木: 金币+3, 鼓励积极交流解答问题 2012-08-28 13:49:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by dxli1988 at 2012-08-26 21:54:33
延伸时间足够是怎么回事，我在前5个循环里延伸5s，因为只有22bp重合，这样可以吗，还有touchdown我也做过，到底是个逐渐升温的过程还是降温的过程呢？...

那这样看你的片段了！你想呀，你的两个片段在体系中扩散各自找配对的，配对的部分只有22bp，后面拖着很长的尾巴，阻力很大，这样两个片段相互之间就不容易配对呀！所以要给与足够的时间，让片段去寻找配对的对象！因为这个过程中两个片段不仅可以相互配对，自身也能配对。这是我个人的理解！我做的touchdown基本上是降温。
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16楼2012-08-27 21:10:13
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dxli1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by chjinzhi at 2012-08-27 21:10:13
那这样看你的片段了！你想呀，你的两个片段在体系中扩散各自找配对的，配对的部分只有22bp，后面拖着很长的尾巴，阻力很大，这样两个片段相互之间就不容易配对呀！所以要给与足够的时间，让片段去寻找配对的对象！ ...

前5个反应也做touchdown吗？
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逆水行舟，不进则退。
17楼2012-08-27 22:14:30
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muscle920

禁虫 (小有名气)
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-28 13:49:21
本帖内容被屏蔽
18楼2012-08-28 01:09:55
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muscle920

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
19楼2012-08-28 01:11:10
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by dxli1988 at 2012-08-27 22:14:30
前5个反应也做touchdown吗？...

你要是知道退火温度就不用啦！我是试了很多温度，后来就试烦了，干脆touchdwn了。
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20楼2012-08-28 10:54:05
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