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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠延伸PCR
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dxli1988

金虫 (小有名气)

[求助] 重叠延伸PCR

最近一直在做重叠延伸PCR,获得第一轮的产物，切胶回收后，在第二轮重叠PCR怎么也做不出来，个人觉得引物没有问题，重叠22bp，本身基因的GC比就不太正常，含量较低，但引物再重新设计的可能性不大，希望各位前辈指点一二。引物序列分别为：
AF: TTAGTTCGGTAGTTGAGGG
AR:  ATAACGTTCATTACTTCTCCAGATTTTGTGTCATTC
BF: CTGGAGAAGTAATGAACGTTATTGCAATATTGAATC
BR: TAGCAGTTCTTATTTTTTGCTTTCTTCTTTCAATACCTTAACGG
A基因片段长为535bp，B片段长为2168bp。
前5个循环不加引物，低温退后，加引物后25循环。这是其中一次梯度PCR的结果。

重叠延伸PCR结果
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逆水行舟，不进则退。
1楼 2012-08-26 18:00:14
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dxli1988

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by aofeng860308 at 2012-08-26 22:02:41
延伸时间5s怎么够？前5个循环的作用是什么要搞清楚，延伸是为了得到连接后的总长度啊，也就是要扩2700左右的片段，好歹也得2-3min啊，后面加引物就是以这段全长为模板进行PCR扩增的。以后再做SOE的时候，一定要保证 ...

我的理解是，前5个反应只是负责搭桥，这一部分只有重叠的部分反应，和全长有直接的关系吗？还有这个退火温度是不是按照重叠部分的Tm值来参考呢？
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逆水行舟，不进则退。
8楼2012-08-26 22:15:30
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dxli1988

金虫 (小有名气)
电泳图中，前4个孔不是，后边的全是。
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逆水行舟，不进则退。
2楼2012-08-26 18:01:05
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lishaohe

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
dxli1988: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-08-26 21:52:46
胶回收后，再做第二轮PCR的前五个反应可以适当延伸一下时间，就是延伸时间变长一些，而且第二轮PCR的退火温度适当再降低一些，延伸时间3min左右吧，我以前经常做重叠PCR，从来没有出现过其他问题，不过我的片段总长在2000bp左右。希望对你有些帮助。
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3楼2012-08-26 19:02:13
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chjinzhi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-08-26 20:41:25
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-08-26 20:41:30
dxli1988: 金币+3, ★★★很有帮助 2012-08-26 21:52:37
我现在也在做这类实验。刚刚无结果，原先的时候和你一样，都不能扩出目的片段，只能得到其中的一条片段。不过后来，我请教些前辈，就做出来了。他们建议我从重叠的片段质量入手，所谓片段质量指的是你加如反应体系的两片段的摩尔比要是1：1，就拿你的片段来说，如果两片段的浓度基本一样，那么二者的体积比就要是4：1（大：小）；再者就是前五个循环里的延伸时间要足够，退火温度要合适！实在确定不了，就用Touch-down吧！若还是出不来，尝试下把循环数增加几个！
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4楼2012-08-26 19:24:59
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