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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸PCR的高手，求助！！！！！
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Daniel_佳

新虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸PCR的高手，求助！！！！！ 已有10人参与

最近想用重叠PCR的方法，融合3个片段，大小分别为480,823,465，是三个同时融合容易还是先两个融再上第三个。第一轮的三个片段都已经得到，后面要做几轮PCR比较好，而且体系怎么加比较合适，用的是PrimeStar Max高保真酶P的。求高手能够详细指点，这只是第一步，后面还要连载体。多谢多谢！！！！！
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1楼 2015-06-29 22:34:54
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Daniel_佳(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-30 13:16:29
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2015-06-29 23:46:28
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
啥都不用说，三个片段放一起，然后两头引物直接p

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2015-06-30 20:15:23
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Daniel_佳(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-30 13:16:37
15bp也能够，3个片段取差不多相同量，直接用最外边两个引物，片段A的正向引物，和片段C的反向引物，直接pcr
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6楼2015-06-30 10:16:01
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普通回帖

Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
这么小，三段一起装，或者拼个全长也是可以的啊
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2楼2015-06-29 22:50:56
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Daniel_佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Tama二等兵 at 2015-06-29 22:50:56
这么小，三段一起装，或者拼个全长也是可以的啊

谢谢您的回复，您能说的详细些吗？
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3楼2015-06-29 23:11:21
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Daniel_佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

如果只有15bp重合，能做吗？
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5楼2015-06-30 09:14:38
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咆粑

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用E-fusion融合酶，直接做链接反应，效力超高。http://www.biophay.com/showpro.asp?id=16&Classid=1仅供参考。
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7楼2015-06-30 15:10:55
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dehong1573

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

正解，
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科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
8楼2015-06-30 18:38:38
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guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
三个一起

[ 发自小木虫客户端 ]
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9楼2015-06-30 19:55:46
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