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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸PCR的高手，求助！！！！！
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江潮

捐助贵宾 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们公司有可以连5个不同片段的试剂盒的，你这很好连，很简单。你可以在网上搜下官网说明书来进一步确定是否使用：南京若唯赞生物科技, 一步法多片段克隆试剂盒（C113-01/02）
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11楼2015-06-30 20:49:05
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主的重叠pcr是做突变么

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
12楼2015-07-01 20:55:11
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feiadafeng

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果可行的话，三个片段做一个约30min的退火过程，并以该混合物为模板进行普通PCR扩增效果也很好。
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13楼2015-07-03 19:24:26
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364785724

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

很多文献都是三个一起P的，P多了容易出事，你懂的。
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14楼2015-07-09 22:28:40
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夏夜微风

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

能问一下，一般模版要多少量吗？模版太多是不是P不出来啊？我就遇到500bp，1200bp，500bp三段融合，后面得出来的是500bp的片段，现在都不知道怎么回事，怎么会后500bp的呢
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还未成熟，就已老去！
15楼2015-07-26 11:04:01
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夏夜微风

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by feiadafeng at 2015-07-03 19:24:26
如果可行的话，三个片段做一个约30min的退火过程，并以该混合物为模板进行普通PCR扩增效果也很好。

30min的退火过程？那要做多少个循环啊？
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还未成熟，就已老去！
16楼2015-07-26 11:10:12
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feiadafeng

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 夏夜微风 at 2015-07-26 11:10:12
30min的退火过程？那要做多少个循环啊？...

三个片段等比例混合， 从98度开始30min内降至室温，就完成了退火。并没有直接进行循环。之后的产物作为模板，进行常规PCR。
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17楼2015-07-27 19:59:16
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
引用回帖:
17楼: Originally posted by feiadafeng at 2015-07-27 19:59:16
三个片段等比例混合， 从98度开始30min内降至室温，就完成了退火。并没有直接进行循环。之后的产物作为模板，进行常规PCR。...

这样做有结果吗？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
18楼2015-08-16 22:54:12
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zhangchong12

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

想问一下，这10-15个循环的体系怎样设置PCR的反应，加入的体系应该是什么。
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19楼2016-03-28 11:24:04
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zhangchong12

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 咆粑 at 2015-06-30 15:10:55
用E-fusion融合酶，直接做链接反应，效力超高。http://www.biophay.com/showpro.asp?id=16&Classid=1仅供参考。

请问片段与片段之间的融合也可以用E-fusion融合酶吗
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20楼2016-03-28 11:26:43
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