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江潮

捐助贵宾 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们公司有可以连5个不同片段的试剂盒的,你这很好连,很简单。你可以在网上搜下官网说明书来进一步确定是否使用:南京若唯赞生物科技, 一步法多片段克隆试剂盒(C113-01/02)
11楼2015-06-30 20:49:05
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主的重叠pcr是做突变么

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
天空没有留下翅膀的痕迹,我却从中飞过
12楼2015-07-01 20:55:11
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feiadafeng

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果可行的话,三个片段做一个约30min的退火过程,并以该混合物为模板进行普通PCR扩增效果也很好。
13楼2015-07-03 19:24:26
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364785724

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

很多文献都是三个一起P的,P多了容易出事,你懂的。
14楼2015-07-09 22:28:40
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夏夜微风

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间,每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合,然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物,正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

能问一下,一般模版要多少量吗?模版太多是不是P不出来啊?我就遇到500bp,1200bp,500bp三段融合,后面得出来的是500bp的片段,现在都不知道怎么回事,怎么会后500bp的呢
还未成熟,就已老去!
15楼2015-07-26 11:04:01
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夏夜微风

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by feiadafeng at 2015-07-03 19:24:26
如果可行的话,三个片段做一个约30min的退火过程,并以该混合物为模板进行普通PCR扩增效果也很好。

30min的退火过程?那要做多少个循环啊?
还未成熟,就已老去!
16楼2015-07-26 11:10:12
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feiadafeng

银虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 夏夜微风 at 2015-07-26 11:10:12
30min的退火过程?那要做多少个循环啊?...

三个片段等比例混合, 从98度开始30min内降至室温,就完成了退火。并没有直接进行循环。之后的产物作为模板,进行常规PCR。
17楼2015-07-27 19:59:16
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lijianfu12

银虫 (正式写手)

引用回帖:
17楼: Originally posted by feiadafeng at 2015-07-27 19:59:16
三个片段等比例混合, 从98度开始30min内降至室温,就完成了退火。并没有直接进行循环。之后的产物作为模板,进行常规PCR。...

这样做有结果吗?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
好好搞学术
18楼2015-08-16 22:54:12
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zhangchong12

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间,每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合,然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物,正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

想问一下,这10-15个循环的体系怎样设置PCR的反应,加入的体系应该是什么。
19楼2016-03-28 11:24:04
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zhangchong12

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 咆粑 at 2015-06-30 15:10:55
用E-fusion融合酶,直接做链接反应,效力超高。http://www.biophay.com/showpro.asp?id=16&Classid=1仅供参考。

请问片段与片段之间的融合也可以用E-fusion融合酶吗
20楼2016-03-28 11:26:43
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