应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 重叠延伸PCR的高手，求助！！！！！
251/3返回列表123下一页
查看: 4581  |  回复: 24
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

Daniel_佳

新虫 (初入文坛)

[求助] 重叠延伸PCR的高手，求助！！！！！ 已有10人参与

最近想用重叠PCR的方法，融合3个片段，大小分别为480,823,465，是三个同时融合容易还是先两个融再上第三个。第一轮的三个片段都已经得到，后面要做几轮PCR比较好，而且体系怎么加比较合适，用的是PrimeStar Max高保真酶P的。求高手能够详细指点，这只是第一步，后面还要连载体。多谢多谢！！！！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-06-29 22:34:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Daniel_佳(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-30 13:16:29
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。
赞一下(4人) 回复此楼
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2015-06-29 23:46:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biosci

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
啥都不用说，三个片段放一起，然后两头引物直接p

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下(2人) 回复此楼
10楼2015-06-30 20:15:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
Daniel_佳(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-30 13:16:37
15bp也能够，3个片段取差不多相同量，直接用最外边两个引物，片段A的正向引物，和片段C的反向引物，直接pcr
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2015-06-30 10:16:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
这么小，三段一起装，或者拼个全长也是可以的啊
赞一下 回复此楼
2楼2015-06-29 22:50:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Daniel_佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Tama二等兵 at 2015-06-29 22:50:56
这么小，三段一起装，或者拼个全长也是可以的啊

谢谢您的回复，您能说的详细些吗？
赞一下 回复此楼
3楼2015-06-29 23:11:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Daniel_佳

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

如果只有15bp重合，能做吗？
赞一下 回复此楼
5楼2015-06-30 09:14:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

咆粑

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用E-fusion融合酶，直接做链接反应，效力超高。http://www.biophay.com/showpro.asp?id=16&Classid=1仅供参考。
赞一下 回复此楼
7楼2015-06-30 15:10:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dehong1573

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2015-06-29 23:46:28
三段一起装省时间，每个片段互相延伸进旁边的片段20bp, 也就是说有40bp重合，然后三个片段混合在一起跑10-15个循环。然后暂停PCR, 加入一对引物，正反引物要结合在拼接后片段最两端的位置。再跑25-30个循环。

正解，
回复此楼
科学永无止境,只有合作共享才能更好地……
8楼2015-06-30 18:38:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guoqin_shiyin

银虫 (正式写手)
三个一起

[ 发自小木虫客户端 ]
回复此楼
9楼2015-06-30 19:55:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Daniel_佳 的主题更新
251/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭