| 查看: 2707 | 回复: 4 | ||
[求助]
重叠延伸PCR（overlap extension PCR）的问题，头疼啊 已有2人参与
|
|
各位大侠，本人最近在做重叠延伸PCR，想把三个基因连接起来，分别是1000bp, 930bp, 1000bp。三个片段通过PCR已经扩增出来了，条带很亮，并且做了胶回收，回收后的浓度分别是192ng/ul, 307ng/ul, 113ng/ul。分别取600ng进行SOE PCR，采用两步法进行的。就是先不加引物50度退火，循环10次，再加上上下游引物55度退火，循环30次，可就是P不出来2930bp的条带。我用于SOE-PCR的引物有40bp的重叠区，退火温度分别是64度和68度。 实在是不知道什么原因了，100ng的模板和50ng的模板都试过了，两两连接也试过了，可都是不行，做了十多次了。头疼啊，有做过的给我指导一下吧！谢谢！ 我想问一下： 1.胶回收后的产物加多大的量作为SOE-PCR合适？ 2.三个基因连接难度大还是两两连接的难度大？ 3.我用两步法进行SOE-PCR合适吗？ 4.我的引物重叠区有40bp是不是太多了，我看论坛里很多都是20bp左右。我的重叠区是包括第一次扩增回收产物的区域的。 |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有128人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 有关重叠PCR的问题求指导，谢谢。。
已经有16人回复
- 重叠PCR比想象中的诡异p几十轮了始终没有拿到大片段
已经有17人回复
- 小片段PCR的问题
已经有8人回复
- PCR的可重复性
已经有27人回复
- 关于测序的问题-双酶切和PCR验证均是对的 但是测序后有重叠现象
已经有8人回复
- 关于重叠PCR的问题~
已经有6人回复
- 3个片段的重叠延伸pcr,pcr反应条件？
已经有7人回复
- 重叠PCR引物，两个片段分别回收后存在杂带是怎么回事
已经有4人回复
- 求关于Overlap PCR(重叠延伸PCR)的具体实验过程及原理
已经有10人回复
- 重叠延伸PCR第一轮做出来了，但是第二轮P不出来
已经有29人回复
- 求助重叠延伸pcr
已经有5人回复
- 3个片段的重叠pcr能否一步到位？
已经有11人回复
- 重叠延伸PCR引物合成求助
已经有15人回复
- 关于融合PCR的问题
已经有14人回复
- 重叠PCR应该怎么做？
已经有9人回复
- 重叠延伸PCR设计引物
已经有3人回复
- 重叠pcr\跳跃pcr的问题
已经有14人回复
- 如何设计重叠延伸PCR引物
已经有14人回复
- 关于PCR鉴定菌种
已经有7人回复
- 【求助/交流】5500bp的片段PCR问题
已经有21人回复
- PCR退火温度
已经有14人回复
2楼2014-04-28 15:00:00
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-04-28 19:02:06
4楼2014-04-29 08:10:23
5楼2014-11-17 17:01:50