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重叠延伸PCR（overlap extension PCR）的问题，头疼啊 已有2人参与
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各位大侠，本人最近在做重叠延伸PCR，想把三个基因连接起来，分别是1000bp, 930bp, 1000bp。三个片段通过PCR已经扩增出来了，条带很亮，并且做了胶回收，回收后的浓度分别是192ng/ul, 307ng/ul, 113ng/ul。分别取600ng进行SOE PCR，采用两步法进行的。就是先不加引物50度退火，循环10次，再加上上下游引物55度退火，循环30次，可就是P不出来2930bp的条带。我用于SOE-PCR的引物有40bp的重叠区，退火温度分别是64度和68度。 实在是不知道什么原因了，100ng的模板和50ng的模板都试过了，两两连接也试过了，可都是不行，做了十多次了。头疼啊，有做过的给我指导一下吧！谢谢！ 我想问一下： 1.胶回收后的产物加多大的量作为SOE-PCR合适？ 2.三个基因连接难度大还是两两连接的难度大？ 3.我用两步法进行SOE-PCR合适吗？ 4.我的引物重叠区有40bp是不是太多了，我看论坛里很多都是20bp左右。我的重叠区是包括第一次扩增回收产物的区域的。 |
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