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wanglixia815

新虫 (正式写手)

[求助] PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片,看看问题出在哪里了。。 已有4人参与

我是菌根的。。。最近做PCR。。共做了三次了,,
最上边的一张图前八个是DNA样,后边两个PCR产品,这次用的电压是110V,跑了30min..体系是50ul.
primer 20uM 个1ul...MyTaq master Mix 25ul..DNA 6ul 和5ul..剩下的用PCR water补齐..电泳时加的量5ul PCR products..5 ul Orange G..
.第二张图
其中两个样没有条带。。电压85V。。25ul 体系。。前四个样 primer各0.5ul (10uM)后四个样 primer各0.5ul (20uM)..MyTaq master Mix;12.5ul,
1ul DNA        电泳 PCR products 3ul   Orange G 3ul
第二张图
。电压85V。。25ul 体系。。 primer各0.5ul (20uM)..MyTaq master Mix;12.5ul, 1ul DNA   电泳 PCR products 2ul   Orange G 2ul
我的体系设置由问题吗?
还有就是我的MyTaq Master Mix...回来在室温下呆了一天,会不会由影响。。谢谢各位了。。第一次做PCR

PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片,看看问题出在哪里了。。


PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片,看看问题出在哪里了。。-1
IMG_0710.JPG
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有点矛盾。有点纠结
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-03-28 11:46:36
从你的描述来看,PCR的体系应该没有问题。
从胶图来看,PCR的产物浓度应该挺大的,你可以少上点样品,或者进行一下稀释。
目前看来有问题的是你的染料,你每次是等体积加入Orange G,不知道这个是为啥?惯例?还是按照说明书来的?从你胶图的条带来看,比较可能的是染料加多了,加上PCR产物很多,所以条带形状不好看。
建议你首先试一下减少染料的量,你可以只添加1/2,1/4,1/8正常添加量的染料,看看PCR效果如何。
2楼2014-03-28 09:16:55
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
条带很深,是不是跑胶加样加多了……
懒病又犯了……
3楼2014-03-28 09:44:15
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wanglixia815

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 09:16:55
从你的描述来看,PCR的体系应该没有问题。
从胶图来看,PCR的产物浓度应该挺大的,你可以少上点样品,或者进行一下稀释。
目前看来有问题的是你的染料,你每次是等体积加入Orange G,不知道这个是为啥?惯例?还是 ...

恩,加燃料根据平时的惯例加得,他们做的DNA跑胶都是1⃣️比一加的,看起来没有问题,我今天试试...谢谢拉。那你说我的产物可以去测序吗
有点矛盾。有点纠结
4楼2014-03-28 13:59:27
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wanglixia815

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱上鱼…… at 2014-03-28 09:44:15
条带很深,是不是跑胶加样加多了……

我第一次➕的5ul,现在改道2ul了
有点矛盾。有点纠结
5楼2014-03-28 14:00:54
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wanglixia815

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 09:16:55
从你的描述来看,PCR的体系应该没有问题。
从胶图来看,PCR的产物浓度应该挺大的,你可以少上点样品,或者进行一下稀释。
目前看来有问题的是你的染料,你每次是等体积加入Orange G,不知道这个是为啥?惯例?还是 ...

恩,加燃料根据平时的惯例加得,他们做的DNA跑胶都是1⃣️比一加的,看起来没有问题,我今天试试...谢谢拉。那你说我的产物可以去测序吗
有点矛盾。有点纠结
6楼2014-03-28 14:49:02
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woolley

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-03-28 14:49:02
恩,加燃料根据平时的惯例加得,他们做的DNA跑胶都是1⃣️比一加的,看起来没有问题,我今天试试...谢谢拉。那你说我的产物可以去测序吗...

可以去测序,除了第三块胶的第三道(有条带的道,从左开始数)好像有些杂条带,不过关系不大。
7楼2014-03-28 16:43:20
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小二郎

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wanglixia815(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-30 22:32:22
你的marker呢?我前几天也出现这种情况,marker都拖带厉害,后来发现是染料是染料使用方法跟一般的不一样,你可以好好看看染料使用说明
8楼2014-03-29 21:10:38
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wanglixia815

新虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 小二郎 at 2014-03-29 21:10:38
你的marker呢?我前几天也出现这种情况,marker都拖带厉害,后来发现是染料是染料使用方法跟一般的不一样,你可以好好看看染料使用说明

我定的marker今天刚到,染料?是gel red吗?我做胶的时候,60ml TBE 1ul gel red,0.9克agarose....
有点矛盾。有点纠结
9楼2014-04-02 20:02:34
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小二郎

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-02 20:02:34
我定的marker今天刚到,染料?是gel red吗?我做胶的时候,60ml TBE 1ul gel red,0.9克agarose.......

你跑下marker试试,如果marker都跑不好,就是你胶或者燃料的问题了,还有你的目的基因大概多长啊?为什么选择1.5%的胶浓度?
10楼2014-04-03 09:50:06
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