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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片，看看问题出在哪里了。。
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wanglixia815

新虫 (正式写手)

[求助] PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片，看看问题出在哪里了。。 已有4人参与

我是菌根的。。。最近做PCR。。共做了三次了，，
最上边的一张图前八个是DNA样，后边两个PCR产品，这次用的电压是110V，跑了30min..体系是50ul.
primer 20uM 个1ul...MyTaq master Mix 25ul..DNA 6ul 和5ul..剩下的用PCR water补齐..电泳时加的量5ul PCR products..5 ul Orange G..
.第二张图
其中两个样没有条带。。电压85V。。25ul 体系。。前四个样 primer各0.5ul (10uM)后四个样 primer各0.5ul （20uM）..MyTaq master Mix;12.5ul,
1ul DNA        电泳 PCR products 3ul   Orange G 3ul
第二张图
。电压85V。。25ul 体系。。 primer各0.5ul （20uM）..MyTaq master Mix;12.5ul, 1ul DNA   电泳 PCR products 2ul   Orange G 2ul
我的体系设置由问题吗？
还有就是我的MyTaq Master Mix...回来在室温下呆了一天，会不会由影响。。谢谢各位了。。第一次做PCR

PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片，看看问题出在哪里了。。


PCR的带不清楚。。。大家帮忙看看图片，看看问题出在哪里了。。-1
IMG_0710.JPG
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有点矛盾。有点纠结
1楼 2014-03-28 02:40:01
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woolley

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-03-28 11:46:36
从你的描述来看，PCR的体系应该没有问题。
从胶图来看，PCR的产物浓度应该挺大的，你可以少上点样品，或者进行一下稀释。
目前看来有问题的是你的染料，你每次是等体积加入Orange G，不知道这个是为啥？惯例？还是按照说明书来的？从你胶图的条带来看，比较可能的是染料加多了，加上PCR产物很多，所以条带形状不好看。
建议你首先试一下减少染料的量，你可以只添加1/2，1/4，1/8正常添加量的染料，看看PCR效果如何。
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2楼2014-03-28 09:16:55
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爱上鱼……

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
条带很深，是不是跑胶加样加多了……
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懒病又犯了……
3楼2014-03-28 09:44:15
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 09:16:55
从你的描述来看，PCR的体系应该没有问题。
从胶图来看，PCR的产物浓度应该挺大的，你可以少上点样品，或者进行一下稀释。
目前看来有问题的是你的染料，你每次是等体积加入Orange G，不知道这个是为啥？惯例？还是 ...

恩，加燃料根据平时的惯例加得，他们做的DNA跑胶都是1⃣️比一加的，看起来没有问题，我今天试试...谢谢拉。那你说我的产物可以去测序吗
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有点矛盾。有点纠结
4楼2014-03-28 13:59:27
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱上鱼…… at 2014-03-28 09:44:15
条带很深，是不是跑胶加样加多了……

我第一次➕的5ul，现在改道2ul了
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有点矛盾。有点纠结
5楼2014-03-28 14:00:54
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by woolley at 2014-03-28 09:16:55
从你的描述来看，PCR的体系应该没有问题。
从胶图来看，PCR的产物浓度应该挺大的，你可以少上点样品，或者进行一下稀释。
目前看来有问题的是你的染料，你每次是等体积加入Orange G，不知道这个是为啥？惯例？还是 ...

恩，加燃料根据平时的惯例加得，他们做的DNA跑胶都是1⃣️比一加的，看起来没有问题，我今天试试...谢谢拉。那你说我的产物可以去测序吗
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有点矛盾。有点纠结
6楼2014-03-28 14:49:02
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woolley

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-03-28 14:49:02
恩，加燃料根据平时的惯例加得，他们做的DNA跑胶都是1⃣️比一加的，看起来没有问题，我今天试试...谢谢拉。那你说我的产物可以去测序吗...

可以去测序，除了第三块胶的第三道（有条带的道，从左开始数）好像有些杂条带，不过关系不大。
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7楼2014-03-28 16:43:20
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小二郎

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wanglixia815(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-30 22:32:22
你的marker呢？我前几天也出现这种情况，marker都拖带厉害，后来发现是染料是染料使用方法跟一般的不一样，你可以好好看看染料使用说明
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8楼2014-03-29 21:10:38
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wanglixia815

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小二郎 at 2014-03-29 21:10:38
你的marker呢？我前几天也出现这种情况，marker都拖带厉害，后来发现是染料是染料使用方法跟一般的不一样，你可以好好看看染料使用说明

我定的marker今天刚到，染料？是gel red吗？我做胶的时候，60ml TBE 1ul gel red,0.9克agarose....
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有点矛盾。有点纠结
9楼2014-04-02 20:02:34
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小二郎

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanglixia815 at 2014-04-02 20:02:34
我定的marker今天刚到，染料？是gel red吗？我做胶的时候，60ml TBE 1ul gel red,0.9克agarose.......

你跑下marker试试，如果marker都跑不好，就是你胶或者燃料的问题了，还有你的目的基因大概多长啊？为什么选择1.5%的胶浓度？
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10楼2014-04-03 09:50:06
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