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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 自己设计的引物，不知道行不行，大家看看
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sxzxs

新虫 (初入文坛)

[求助] 自己设计的引物，不知道行不行，大家看看 已有4人参与

自己设计的qPCR引物，新手一个，不知道行不行，大家帮着看一看呗，谢谢了。

目的蛋白：Rattus norvegicus iodotyrosine deiodinase (Iyd)
NCBI Reference Sequence: NM_001025000.1
Sequence (5'->3') Length Tm GC% Self complementarity Self 3' complementarity
Forward primer AGGAGTACTTGGACACTGCC 20 59.02 55.00 6.00 3.00
Reverse primer AGACGAGGACCACAGTTGAG 20 59.04 55.00 3.00 2.00

目的蛋白：sodium/iodide cotransporter [Rattus norvegicus]
NCBI Reference Sequence: NP_443215.2

Sequence (5'->3') Length Tm GC% Self complementarity Self 3' complementarity
Forward primer GTGCCGACGACTTCTTTACC 20 58.93 55.00 3.00 0.00
Reverse primer ATCGGCAAGAAGAGAAACGC 20 58.92 50.00 2.00 2.00


目的蛋白：pendrin [Rattus norvegicus]
NCBI Reference Sequence: NP_062087.1

Sequence (5'->3') Length Tm GC% Self complementarity Self 3' complementarity
Forward primer CCCAGCACAGACATCTACAAA 21 57.94 47.62 4.00 0.00
Reverse primer CCAACTGTTGACTTGACGCA 20 58.99 50.00 7.00 2.00
有高手给指点一下呗，或者帮我设计一下也行，谢谢
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1楼 2014-03-07 14:51:11
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liulugang

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-08 17:39:47
没太大问题，引物3‘端不能是A，最后的引物可以重新设计下。
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2楼2014-03-07 18:03:10
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sxzxs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liulugang at 2014-03-07 18:03:10
没太大问题，引物3‘端不能是A，最后的引物可以重新设计下。

有人说第二个 引物二聚体有点严重，△G一般不应超过5，有影响么。最后的那个不好设计啊，要不，烦劳你帮我设计下。
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3楼2014-03-07 19:42:50
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-08 17:40:06
大体上都可以，最后一组的反向引物可能会有些发卡结构，我给你个网址你自己可是看看引物好用否。http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html
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hehe
4楼2014-03-07 21:13:26
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-08 17:40:33
楼主有没有使用软件？

自己设计（用眼看）的话，GC含量一般很好控制的50%的吧。

有没有Blast，看引物特异性怎么样？
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5楼2014-03-07 22:00:28
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by sxzxs at 2014-03-07 19:42:50
有人说第二个 引物二聚体有点严重，△G一般不应超过5，有影响么。最后的那个不好设计啊，要不，烦劳你帮我设计下。...

引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。
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6楼2014-03-07 23:10:04
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youlinglyw

荣誉版主 (著名写手)

一匡天下

优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-03-08 17:40:42
我一般用primer5，这个可以给打分

你可以用oligo去分析一下引物问题
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天行健
7楼2014-03-07 23:16:17
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sxzxs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-03-07 22:00:28
楼主有没有使用软件？

自己设计（用眼看）的话，GC含量一般很好控制的50%的吧。

有没有Blast，看引物特异性怎么样？

我不太懂，同学帮我设计得，用的primer3，特异性都没问题，就是怕里面有什么别的结构有影响
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8楼2014-03-08 10:01:52
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sxzxs

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by youlinglyw at 2014-03-07 23:16:17
我一般用primer5，这个可以给打分

你可以用oligo去分析一下引物问题

oligo 没用明白啊，不会用，要不，烦劳您帮我评价下，新手，心里没底啊
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9楼2014-03-08 10:04:45
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