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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 连接转化的问题
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jmh5d

铜虫 (初入文坛)

[求助] 连接转化的问题 已有2人参与

做了几次连接转化都不行，没有菌落，培养基上光秃秃的。我连接是5ul体系，4ul回收产物1ulPEASK-T3,25度20min，pcr控温。感受态用的天根的T1。小白求助啊。马上要过年了回收的DNA也快2星期了，一直-20放着，年前不行的话就悲催了。我是想测序，单纯的就是测DNA序列，大概3000bp左右。求大神指导问题出哪或者方法步骤借鉴给小弟一下，谢啦
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希望实验可以顺顺利利
1楼 2014-01-08 09:37:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

三蛰

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-01-08 11:45:55
看你用的是T1载体，估计应该是用pEASY载体，这个方法很成熟也比较容易，看看你是否忽略了以下几点：
1，你PCR时用的Taq酶能否在产物的3‘端产生polyA末端；
2，平板抗性（一般是Amp），是否过量。
3，有时候感受态细胞很脆弱，如果出现过反复冻融最好不用了，也就是看一看感受态的质量。
4，最重要的一点，你的转化操作可能出现了问题：因为不论你是否连接成功（就算出现转化后的载体自连），只要转化成功，就会有菌落在抗性板子上生长。
    总之，3和4是你要重点考虑的。
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jmh5d
我不会！
2楼2014-01-08 10:17:33
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aoaoshch

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 艰苦温度 at 2014-01-10 10:48:28
如何在DNA末端加A?...

嗯，，，，
就是构建一个简单的PCR体系，包含Taq酶、Buffer、dNTPs、水，无需引物，在PCR仪里直接开72度保温10至30min，即可。
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jmh5d
9楼2014-01-10 15:51:13
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普通回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-01-09 08:54:07
引用回帖:
2楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-08 10:17:33
看你用的是T1载体，估计应该是用pEASY载体，这个方法很成熟也比较容易，看看你是否忽略了以下几点：
1，你PCR时用的Taq酶能否在产物的3‘端产生polyA末端；
2，平板抗性（一般是Amp），是否过量。
3，有时候感受 ...

听我这边师兄说回收的DNA放久了，3‘端的polyA末端容易丢失就不容易连接上了。可以的话最好重新回收DNA
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3楼2014-01-08 13:38:04
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-01-09 08:54:10
你的PCR纯化产物浓度调的的合适吗？我实验室常出现这样浓度不要太高。
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hehe
4楼2014-01-08 18:18:07
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三蛰

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shiliyusly at 2014-01-08 13:38:04
听我这边师兄说回收的DNA放久了，3‘端的polyA末端容易丢失就不容易连接上了。可以的话最好重新回收DNA...

但是就算连不上，载体自连，只要能够转化到感受态中，就应该长菌，你现在不是什么菌都不长吗？我觉得还是感受态或者转化的问题。
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我不会！
5楼2014-01-08 22:40:19
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-08 22:40:19
但是就算连不上，载体自连，只要能够转化到感受态中，就应该长菌，你现在不是什么菌都不长吗？我觉得还是感受态或者转化的问题。...

你可以看下是不是氨苄失活了，如培养基加氨苄的温度，氨苄的保存等。
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6楼2014-01-09 17:13:44
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aoaoshch

木虫 (小有名气)
把你的DNA重新加A，在连一次试试
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7楼2014-01-09 19:54:48
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艰苦温度

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by aoaoshch at 2014-01-09 19:54:48
把你的DNA重新加A，在连一次试试

如何在DNA末端加A?
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8楼2014-01-10 10:48:28
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jmh5d

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shiliyusly at 2014-01-08 13:38:04
听我这边师兄说回收的DNA放久了，3‘端的polyA末端容易丢失就不容易连接上了。可以的话最好重新回收DNA...

这个我还真没考虑，放了大概3个星期了快

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希望实验可以顺顺利利
10楼2014-01-12 08:26:13
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