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连接转化的问题 已有2人参与
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| 做了几次连接转化都不行，没有菌落，培养基上光秃秃的。我连接是5ul体系，4ul回收产物1ulPEASK-T3,25度20min，pcr控温。感受态用的天根的T1。小白求助啊。马上要过年了回收的DNA也快2星期了，一直-20放着，年前不行的话就悲催了。我是想测序，单纯的就是测DNA序列，大概3000bp左右。求大神指导问题出哪或者方法步骤借鉴给小弟一下，谢啦 |
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5楼2014-01-08 22:40:19
【答案】应助回帖
★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-01-08 11:45:55
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2014-01-08 11:45:55
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看你用的是T1载体，估计应该是用pEASY载体，这个方法很成熟也比较容易，看看你是否忽略了以下几点： 1，你PCR时用的Taq酶能否在产物的3‘端产生polyA末端； 2，平板抗性（一般是Amp），是否过量。 3，有时候感受态细胞很脆弱，如果出现过反复冻融最好不用了，也就是看一看感受态的质量。 4，最重要的一点，你的转化操作可能出现了问题：因为不论你是否连接成功（就算出现转化后的载体自连），只要转化成功，就会有菌落在抗性板子上生长。 总之，3和4是你要重点考虑的。 |
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jmh5d2楼2014-01-08 10:17:33
shiliyusly
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3楼2014-01-08 13:38:04
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4楼2014-01-08 18:18:07
