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永远一片天

新虫 (正式写手)

[求助] 求双酶切连接、载体构建等信息~ 已有2人参与

最近学习双酶切，但太泛了，完全没有头绪，如何在引物两端加酶切位点也一头雾水，如何选择载体？如何构建载体？？等等
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1楼 2014-01-01 19:57:04
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
永远一片天: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-06 19:59:51
引用回帖:
4楼: Originally posted by 永远一片天 at 2014-01-03 21:59:51
你好，我想请问一下如何在引物两端加保护碱基呢？酶切位点的两端都加吗？网上有许多保护碱基 的汇总，但不知道是否可靠？...

这个没什么要求只要不形成明显的二级结构就可以，根据引物的GC含量高了就加at多一些，低了就加一些GC
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hehe
6楼2014-01-04 09:11:28
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-01-02 12:09:28
永远一片天: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-03 21:52:51
双酶切不应该觉得太麻烦，就是把两种酶在合适的Buffer里工作就可以了。引物前加酶切位点也很好弄，把自己需要用的酶切序列添加到引物前段保证引物匹配序列不低于15bp就好。同时在酶切位点前加几个保护碱基。载体选择根据你的需要定，有合适的酶切位点。构建也一样根据需要。
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hehe
2楼2014-01-02 08:57:09
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-01-02 12:09:35
永远一片天: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-01-03 21:53:01
你可以看看pET原核表达手册，里面讲了很多理论知识，虽然主要是原核表达载体方面的构建，但也可以满足你的需求。
另外不知道你做双酶切构建载体是用于哪一方面，所以是不能具体地和你讲怎么做到。不管怎样，选择酶切位点或者载体构建，都是和你的实验目的以及序列相关。酶切位点不能是目的序列里面有的，做上下游加入酶切位点的方向要与载体的方向一致。
很多酶的厂家，例如takara/neb/fermentas等网站上都有相关的技术手册，可以参考。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
3楼2014-01-02 09:28:36
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永远一片天

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2014-01-02 08:57:09
双酶切不应该觉得太麻烦，就是把两种酶在合适的Buffer里工作就可以了。引物前加酶切位点也很好弄，把自己需要用的酶切序列添加到引物前段保证引物匹配序列不低于15bp就好。同时在酶切位点前加几个保护碱基。载体选择 ...

你好，我想请问一下如何在引物两端加保护碱基呢？酶切位点的两端都加吗？网上有许多保护碱基 的汇总，但不知道是否可靠？
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4楼2014-01-03 21:59:51
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