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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 荧光定量PCR溶解曲线问题
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zzl2516

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量PCR溶解曲线问题 已有4人参与

本人做荧光定量PCR，做标曲是5倍稀释了5个点，用的是两步法，95度15s，63度1分钟，但是标曲后两个点也就是浓度低的两个点总是有杂峰，不知道应该怎么调整反应条件，求大神指导
荧光定量PCR溶解曲线问题
这是5个点的溶解曲线
荧光定量PCR溶解曲线问题-1
荧光定量PCR溶解曲线问题-2
这是后两个点的溶解曲线
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1楼 2013-12-16 08:56:43
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zzl2516

金虫 (小有名气)
没人回我。。自己顶一顶。。。
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2楼2013-12-17 10:48:25
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2011210200

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-12-18 08:57:13
个人觉得，应该不是反应条件的问题，问题可能出在引物设计、和PCR体系配制的污染上。从你的溶解曲线上看，有很多峰值，说明有非特异性扩增或是大量的引物二聚体形成。
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3楼2013-12-17 20:00:54
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jennifermatt

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

学习一下。我只遇到过一个杂峰的情况
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求是
4楼2013-12-26 09:17:59
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president114

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

模板调成 150 ng/ul，你可以把稀释倍数换一下 1 4 16 64 256，,5倍稀释最后几个基本上就检测不到了~
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行路难多歧路
5楼2014-04-28 11:03:36
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什么果

新虫 (初入文坛)
你好~我最近在做标准曲线~想问一下~你的模板cDNA母液i是直接反转录得到的还是稀释后的
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6楼2015-10-05 18:05:54
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什么果

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by president114 at 2014-04-28 11:03:36
模板调成 150 ng/ul，你可以把稀释倍数换一下 1 4 16 64 256，,5倍稀释最后几个基本上就检测不到了~

你好~你的意思是说先把模板调成150ng/ul，再以此为母液进行倍比稀释吗~
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7楼2015-10-05 18:28:05
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凡人凡语1

新虫 (小有名气)
你没有跑过温度梯度吗？也有可能是引物没有设计好，还有就是mix也有可能导致

发自小木虫Android客户端
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8楼2015-10-06 13:08:06
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你是路人甲

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

溶解曲线是为了观察我们扩增发出荧光的片段是不是我们需要的产物。我们用BIOG荧光定量PCR盒子检测了DNA,如果溶解曲线做出来只有单峰，且出锋位置是你的退火温度，那么这个是你的产物发出的荧光，实验结果表示有效。
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9楼2020-02-18 11:18:46
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