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lipingzhou

银虫 (初入文坛)

[求助] RT-PCR电泳结果各位帮忙看看是什么原因

大家帮我看看RT-PCR电泳结果，我该怎么办，走投无路了。首尾是marker100-600bp的，第一部分的4个孔是324bp的，现在却P成分子量好大的；第二部分4个孔是263bp的，隐约可见；第三部分4个孔是360bp的，最后4个孔是内参318bp的，几乎没有。每个泳道下面都有糊状，怎么会这样，我该怎么改进？ 我的PCR条件是94度3min后94度30s，56度30s，72度45s，30个循环，72度5min。怎么改进？
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1楼 2013-11-19 16:06:35
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lipingzhou

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-20 13:34:02
你的引物浓度已经很低了，一般终浓度在0.1-0.5μM。引物是自己设计的？是否优化过PCR条件？做RT样品前，可以先用gDNA摸索一下引物扩增的最优条件。
用cDNA为模板PCR时循环数目要根据目标基因的表达丰度来定。你做 ...

谢谢，学习了。我的引物是公司设计的，样品是总RNA提的，跑了电泳效果还可以。我结果是要半定量的，现在是有时候P的出来，但是下面都会有糊状一段，有时什么的P不出来
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5楼2013-11-20 13:48:36
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
下面的是引物二聚体，说明PCR的效率不好，原因可能是引物二级结构严重或者PCR体系引物量太高。不知道你PCR体系里的引物终浓度是多少？关于第一部分的产物大小不对的问题，先问下你做的样品是原核生物的还是真核生物的，引物设计是否跨了内含子？
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2楼2013-11-20 07:46:12
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lipingzhou

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-20 07:46:12
下面的是引物二聚体，说明PCR的效率不好，原因可能是引物二级结构严重或者PCR体系引物量太高。不知道你PCR体系里的引物终浓度是多少？关于第一部分的产物大小不对的问题，先问下你做的样品是原核生物的还是真核生物 ...

我的引物是5uM的加1uL，体系50uL。我的是真核，动物脑组织样品，内含子这些我不懂啊，我是菜鸟。现在我的引物还要减少吗？现在连最后的内参都没有？大神请帮忙
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3楼2013-11-20 13:13:18
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lipingzhou at 2013-11-20 13:13:18
我的引物是5uM的加1uL，体系50uL。我的是真核，动物脑组织样品，内含子这些我不懂啊，我是菜鸟。现在我的引物还要减少吗？现在连最后的内参都没有？大神请帮忙...

你的引物浓度已经很低了，一般终浓度在0.1-0.5μM。引物是自己设计的？是否优化过PCR条件？做RT样品前，可以先用gDNA摸索一下引物扩增的最优条件。
用cDNA为模板PCR时循环数目要根据目标基因的表达丰度来定。你做RT-PCR的目的是扩增出cDNA片段，还是要定量？如果只是要P出目标基因就比较简单，只需先做一个预实验，然后调整循环数目和模板多少就可以比较理想地扩增出目标条带。如果要定量，需要在预实验的基础上做不同循环数目确定样品扩增出来的条带未到饱和，这样才有定量的意义。
你的扩增效果不好可能还与样品有关。你的RNA提得怎么样，用的是总RNA还是mRNA反转录的？RNA样品反转录前消化DNA是否完全？
做真核样品的RT-PCR在引物设计时一般会选择跨越内含子，这样可以区分条带是由gDNA扩增出来的还是cDNA扩增出来的。
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4楼2013-11-20 13:34:02
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