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许三多

木虫 (著名写手)

[求助] 重组质粒测序有点突变,这样的重组质粒还能用吗?

各位高人请帮忙!!
我用pET-22b(+)构建重组质粒,做原核表达。测序结果回来,发现有两个点突变,并且相应的氨基酸也变了,如图红色方框。
这样的情况,我重组的质粒还能用吗?
或者,能否有办法来判断下,突变后的蛋白结构的变化有多大吗?
重组质粒测序有点突变,这样的重组质粒还能用吗?
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲,勿施于人

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
许三多: 金币+10, 有帮助 2013-09-22 10:52:58
这种刚好少一个氨基酸的比较少见啊,一般如果是构建质粒时候出错都是出现frame shift或者某个点突变
你这个比对的是构建质粒前和构建质粒后的序列吗
还是就是把你质粒的序列和数据库进行比对
有的蛋白有不同的isoform,可能你这个就刚好是另一种isoform,不影响功能的
建议你再仔细查查数据库,有没有其他isoform
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
4楼2013-09-22 08:15:25
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
许三多: 金币+5, 有帮助 2013-09-22 18:17:21
引用回帖:
7楼: Originally posted by 许三多 at 2013-09-22 11:39:01
这两个位点中,有一个在以前的测序中出现过的。我能否认为,这不是酶的问题,是我模板变化的原因呢?...

这很有可能,两个突变,一个来自于模板。
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
11楼2013-09-22 16:43:46
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普通回帖

xuaoua

新虫 (初入文坛)

重新构建吧。
2楼2013-09-22 04:53:29
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-22 08:13:19
许三多: 金币+5, 有帮助 2013-09-22 11:38:45
这种情况就重新构建吧,你无法确定氨基酸变化是否对蛋白的结构与功能产生影响
植物生理群69993869,为避免广告,申请加入请提供木虫昵称,院校及专业信息
3楼2013-09-22 05:41:52
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许三多

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-09-22 08:15:25
这种刚好少一个氨基酸的比较少见啊,一般如果是构建质粒时候出错都是出现frame shift或者某个点突变
你这个比对的是构建质粒前和构建质粒后的序列吗
还是就是把你质粒的序列和数据库进行比对
有的蛋白有不同的iso ...

你好,非常谢谢你的回复。
是这样子的,我是拿的构建后的目的片段比对的,据库里序列就是我提交的。
我也再按照你说的去找找看,但愿会如你所说吧。
谢谢
5楼2013-09-22 10:57:08
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许三多

木虫 (著名写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xuaoua at 2013-09-22 04:53:29
重新构建吧。

这两个位点中,有一个在以前的测序中时出现过的。我能否认为,这不是酶的问题,是我模板变化的原因呢?
6楼2013-09-22 11:37:28
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许三多

木虫 (著名写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by starseacow at 2013-09-22 05:41:52
这种情况就重新构建吧,你无法确定氨基酸变化是否对蛋白的结构与功能产生影响

这两个位点中,有一个在以前的测序中出现过的。我能否认为,这不是酶的问题,是我模板变化的原因呢?
7楼2013-09-22 11:39:01
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许三多

木虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-09-22 08:15:25
这种刚好少一个氨基酸的比较少见啊,一般如果是构建质粒时候出错都是出现frame shift或者某个点突变
你这个比对的是构建质粒前和构建质粒后的序列吗
还是就是把你质粒的序列和数据库进行比对
有的蛋白有不同的iso ...

还有啊,我这个并没有少一个氨基酸的?
8楼2013-09-22 11:41:43
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RUI1990

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
许三多: 金币+5 2013-09-22 13:26:37
这个重组质粒应该是不能用了,还是重新构建载体吧,祝你好运!
做自己
9楼2013-09-22 11:57:32
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许三多

木虫 (著名写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by RUI1990 at 2013-09-22 11:57:32
这个重组质粒应该是不能用了,还是重新构建载体吧,祝你好运!

数据库里的序列就是我提交的。这次出现的情况我一时也反映不过来了。我想再制一批模板跑PCR测序看看。因为我发现在酶切前的测序中,也存在第二个点突变,且是A的突变。所以我想如果我能证明不是Taq酶的问题,我这个就有可能是isoform,那就安心多了。
谢谢你!
10楼2013-09-22 13:30:08
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