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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 试剂盒提质粒？？？？
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风吹我已散

木虫 (正式写手)

[交流] 试剂盒提质粒？？？？

最近用QIGEN试剂盒提大肠杆菌中的质粒，提出来浓度好低啊，才80ng/u；自己又用手提法提，结果很好。但是粗提的质粒用来转化肯定不好。用试剂盒提了3次了，浓度都很低啊，到底是什么问题呢？
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1楼 2013-09-04 20:34:16
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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风吹我已散: 金币+2 2013-09-05 08:48:06
除了操作手法不行之外，应该没别的问题。能否详细说说你操作的具体过程？

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2楼2013-09-04 23:32:15
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
★
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最后一步的时候躲在小柱上吸附一段时间
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3楼2013-09-04 23:34:48
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忽而今秋

铜虫 (初入文坛)
★ ★
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风吹我已散: 金币+1 2013-09-05 08:25:00
我们用的axgen还不错。有可能产品批次的问题。溶解的时候加水多溶解会儿。

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4楼2013-09-05 00:10:24
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-04 23:32:15
除了操作手法不行之外，应该没别的问题。能否详细说说你操作的具体过程？

质粒大小：8K左右；都是按试剂盒上的步骤啊：
1. 50ml过夜菌液离心5000rpm 10分钟
2. 将沉淀重悬于4ml Buffer P1
3. 加4ml Buffer P2， 上下颠倒4~6次，在室温静置5min
4.加在4度冰箱放置的Buffer P3， 轻轻混匀至蓝色变为白色，于冰上静置15min
5.12000 rpm, 4度下离心30min
6.QIAGEN-tip 平衡， 加4ml BufferQBT
7.吸取步骤5中的上清于BufferQBT中吸附
8.用10ml 的BufferQC 冲洗QIAGEN-tip柱子两遍（2*10ml)
9.取一只新的管子，用5ml BufferQF冲洗柱子
10.在管中加入3.5ml 的异丙醇来沉淀DNA,混匀后分装成几个小管（约6个1.5ml），4度放 置 30min，之后4度下离心20min,轻轻倒掉液体。
11. 用75%的乙醇（2ml)冲洗DNA, 轻轻上下颠倒，12000 rpm 离心10min，轻轻倒掉液体。
12. 在室温下静置5-10min,用dd水溶解DNA.
在10步之后应该看到有白色的DNA啊，可是我的看不到。
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5楼2013-09-05 08:47:57
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
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qiagen的试剂盒这么麻烦吗？好像和我的步骤不一样呢，麻烦这么多的
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6楼2013-09-05 11:54:11
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loveskyzhou

铁虫 (正式写手)
★
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用了多少菌液呢？
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7楼2013-09-05 12:37:44
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by loveskyzhou at 2013-09-05 12:37:44
用了多少菌液呢？

50ml
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8楼2013-09-05 14:52:41
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风吹我已散

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by sxxuan at 2013-09-05 11:54:11
qiagen的试剂盒这么麻烦吗？好像和我的步骤不一样呢，麻烦这么多的

你用的也是这个试剂盒么，你的步骤是怎样的啊？
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9楼2013-09-05 15:12:42
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by 风吹我已散 at 2013-09-05 08:47:57
质粒大小：8K左右；都是按试剂盒上的步骤啊：
1. 50ml过夜菌液离心5000rpm 10分钟
2. 将沉淀重悬于4ml Buffer P1
3. 加4ml Buffer P2， 上下颠倒4~6次，在室温静置5min
4.加在4度冰箱放置的Buffer P3， 轻轻混 ...

这个盒子我没有用过，我做质粒中提用的是OMEGA的盒子。不过，对比之下，你的这个盒子很麻烦，为什么过柱子后还需要自己异丙醇沉降？另外，我提gDNA是用无水乙醇沉降的，不知道质粒为什么用异丙醇。
不过，好像并没有帮到你，不好意思啊

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10楼2013-09-05 18:38:05
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ykluuniu

金虫 (小有名气)
★
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另外，你应该了解一下这个试剂盒里的所有试剂的作用，有助于找出原因。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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11楼2013-09-05 18:40:56
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2008101111

金虫 (正式写手)
★
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这个试剂盒也太麻烦了，没见过这么多步骤的，换其他家的试试，推荐OMEG
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12楼2013-09-06 09:33:11
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grape_vine

金虫 (小有名气)
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引用回帖:
10楼: Originally posted by ykluuniu at 2013-09-05 18:38:05
这个盒子我没有用过，我做质粒中提用的是OMEGA的盒子。不过，对比之下，你的这个盒子很麻烦，为什么过柱子后还需要自己异丙醇沉降？另外，我提gDNA是用无水乙醇沉降的，不知道质粒为什么用异丙醇。
不过，好像并没 ...

异丙醇和乙醇的效果差不多,但所用体积更小!
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13楼2013-09-06 09:52:34
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
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引用回帖:
5楼: Originally posted by 风吹我已散 at 2013-09-05 08:47:57
质粒大小：8K左右；都是按试剂盒上的步骤啊：
1. 50ml过夜菌液离心5000rpm 10分钟
2. 将沉淀重悬于4ml Buffer P1
3. 加4ml Buffer P2， 上下颠倒4~6次，在室温静置5min
4.加在4度冰箱放置的Buffer P3， 轻轻混 ...

你这是中抽吧，浓度居然这么低
试剂盒出问题了，我们之前用他家的胶回收，回收浓度也是突然从60ng/ul降到10ng/ul，害的我要多切一条带才够用
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14楼2013-09-10 14:39:51
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