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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变后转化，提质粒提不出来，求亲们帮帮忙
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)

[求助] 定点突变后转化，提质粒提不出来，求亲们帮帮忙

亲们，帮帮忙！
   我现在在做点突变，PCR有条带，就做了转化，涂了几个板，过夜培养，有一个板长得很好，其他的长得不是很好，就培养了将近15个多小时，然后挑十几个菌摇，菌体都可以生长，提质粒后跑电泳却只有一两个有条带；比较土的方法（自己配置溶液提质粒）和试剂盒体质粒都用了，做了很多的无用功，想问一下这是怎么回事，亲们做这种实验也遇到过类似的状况吗？！着急啊亲们，还请高手多多指教啊！万分感谢！
   转化是通用的方法，取了6μl的PCR产物加入到70μl的感受态中，冰浴30min，热激90s，冰浴3min，然后用温浴的无抗LB复苏一个半小时，5000r离心2min，然后涂在含有Kna抗生素的LB板上，过夜培养！说明书上是要求热激30s，做了两次不行，就做了对照，然后还是选择了90s！ 摇菌时用的液体培养基也是含有卡纳抗生素的！
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1楼 2012-10-21 10:13:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-19 13:58:21
有几点不明白
1. 为什么是直接拿PCR产物做转化？你P的东西是含有细菌ori和卡那霉素抗性基因吗？
2. 复苏后为什么要离心而不是直接涂板？

菌长但没质粒会不会是卡那失效了？你说做了对照，是正对照还是负对照？
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2楼2012-10-21 13:28:06
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diandong

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
3楼2012-10-21 18:43:40
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yiyijiayou21

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by diandong at 2012-10-21 18:43:40
PCR反应后，用DNPI酶消化后，直接转化。平板没有长菌或很少菌，没有P出来的可能性太大了，长出来的基本是。

亲，还想问一个问题，就是挑菌后，提质粒，然后跑电泳时就发现提的质粒跑不出来条带，测的OD值也是正常的，而且又是后挑菌后液体培养会发现很多都长不出来！不知道是怎么回事？！
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4楼2012-11-19 11:13:13
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