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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于分步酶切
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apple319

禁虫 (初入文坛)
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1楼 2013-08-06 10:35:35
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by apple319 at 2013-08-06 14:04:26
太谢谢了啊，是用的TAKALA的酶，SmaI和SpeI的反应温度一个是30度，一个是37度，可以使用双酶切吗？而且SpeI用那个缓冲液条件加括号了是什么易受star活性影响，请问是什么意思啊？...

星号活性：SpeI在低离子强度条件下，识别序列会发生变化。
SmaI在37度反应也表现出相同的酶活性，但同30度相比，稳定性稍差。
TAKALA书上都有的。
双酶切之后回收片段浓一点，再酶连应该没有什么问题的
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6楼2013-08-06 14:36:31
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
现在好多公司都有通用Buffer的，不同的酶在同一Buffer里都有较高的活性，而且反应条件相同。使用起来很是方便。我用的是Fermentas的酶，你可以参考下。
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2楼2013-08-06 10:43:43
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议使用TAKALA的酶，SmaI和SpeI双酶切，用反应体系终浓度1XT buffer+BSA
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3楼2013-08-06 12:21:56
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apple319

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4楼2013-08-06 14:04:26
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apple319

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5楼2013-08-06 14:12:54
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apple319

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7楼2013-08-06 14:47:38
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joan198108

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
既然最适温度不同只能分布切，可以用fermentas或者TaKaRa的fastdigest（Quickcut）采用通用buffer，逐次添加不同酶，分别切割，最后一块回收。希望对你有帮助。
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8楼2013-08-06 15:11:53
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huanghznd

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by apple319 at 2013-08-06 14:47:38
啊！！！太感谢了，因为最近反复做这个，都让自己灰心了，那意思是直接37度进行双酶切就行了？嗯，还有就是麻烦问一下，SpeI识别序列发生变化但是对于我们酶切加连接会没有影响吗？请问您也用过这两个酶切位点吗？...

SpeI识别序列发生变化之后，它切的位点就不知道是哪里了喔，但对整体而言也是有影响的，但对于你做酶连，只要有正确切割的位点，应该也是很容易连上去的。
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9楼2013-08-06 15:37:40
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试试把SmaI换成XmaI, 它们辨认同样的序列, 前者切出的是平端后者是粘端, 连接的时候后者效率更好.
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10楼2013-08-06 16:00:40
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