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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取的RNA样本，经过DNA酶处理，但总是处理不干净
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达菲鸭

新虫 (初入文坛)

[求助] 提取的RNA样本，经过DNA酶处理，但总是处理不干净

我们用qiagen的试剂盒提取了弧菌的RNA，然后用fermentas的cDNA试剂盒里面的DNA酶和buffer来去除gDNA。但是处理后的RNA经PCR检测竟然还是P出了目的产物，这会影响后面的qPCR。

我们以前做过几次，没有遇到这个问题啊，以前都是P不出来的。

可能是RNA的样品中的杂质影响了dna酶的工作么？因为我们后来换了一家的国产的试剂盒同样没有处理干净。这一次提的RNA，有几管的260/280,260/230都在2.1在2.1左右，应该还比较纯吧，但也还是除不干净DNA。

有没有谁知道是什么原因吗？求赐教，十分感谢！
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1楼 2013-07-21 13:10:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:10:07
可能是样品太多，酶加少了。DNase消化要根据样品的量来做，可以参考酶的说明书。
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2楼2013-07-21 14:23:56
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yilunanxia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
达菲鸭(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-22 20:10:37
PCR出了目标条带就是说你的RNA里有DNA了，加大DNase吧
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3楼2013-07-21 16:07:37
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达菲鸭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-21 14:23:56
可能是样品太多，酶加少了。DNase消化要根据样品的量来做，可以参考酶的说明书。

啊，fermentas的试剂盒说的是1μg的RNA不要使用超过1个单位的DNA酶，然后我就是按这个量加的。难道应该把酶的量再加大一些吗？
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4楼2013-07-21 18:15:16
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
达菲鸭: 金币+5 2013-07-22 18:00:05
引用回帖:
4楼: Originally posted by 达菲鸭 at 2013-07-21 18:15:16
啊，fermentas的试剂盒说的是1μg的RNA不要使用超过1个单位的DNA酶，然后我就是按这个量加的。难道应该把酶的量再加大一些吗？...

的确一般是这么加的，可能你的样品的DNA含量比较多，试试增加一点。
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5楼2013-07-21 21:15:10
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达菲鸭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-21 21:15:10
的确一般是这么加的，可能你的样品的DNA含量比较多，试试增加一点。...

额，我把DNA酶的量x2和x3以后来处理，结果还是P出来了，
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6楼2013-07-22 18:01:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
小丹木木: 金币+1, 专家考核, 辛苦 2013-07-23 11:11:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by 达菲鸭 at 2013-07-22 18:01:37
额，我把DNA酶的量x2和x3以后来处理，结果还是P出来了，...

不应该呀。是不是你的反应体系浓度太高了？还有，你用水做模板能不能P出来？我想是不是体系污染了。
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7楼2013-07-23 00:32:05
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-07-23 11:09:53
达菲鸭: 金币+14, ★有帮助, 4 2013-07-24 13:10:13
其实是很容易P出来的。
可以试一下分两次加DNase （先正常消化，然后再加再消化一次。）
另外也可以尝试换life(ambion)的DNase 酶。
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伟大航线....
8楼2013-07-23 08:27:54
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达菲鸭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2013-07-23 08:27:54
其实是很容易P出来的。
可以试一下分两次加DNase （先正常消化，然后再加再消化一次。）
另外也可以尝试换life(ambion)的DNase 酶。

我以前做了几次，都没有P出来，上次做的，两管不同的样品，都P出相应的条带了。这一次我又提了一次RNA，正在试试，上次提RNA的时候好像有些不好，加乙醇的时候乙醇是刚从4度里拿出来的，很冰，qiagen要求全程都保持在室温不能变，另外之前好像也没完全打散菌体......总之这一次再试试看
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9楼2013-07-24 13:17:58
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达菲鸭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by longrna at 2013-07-23 08:27:54
其实是很容易P出来的。
可以试一下分两次加DNase （先正常消化，然后再加再消化一次。）
另外也可以尝试换life(ambion)的DNase 酶。

对了，分两次消化有什么好处呢？
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10楼2013-07-24 14:05:21
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