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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手提RNA，请教几个问题
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ln031101

铜虫 (小有名气)

[求助] 新手提RNA，请教几个问题

小鼠脾细胞，用试剂盒提的RNA，提了两次结果都差不多，所有器皿我都已经处理过了，这是降解的很严重吗？
1，整个提取过程需要在冰上进行吗？试剂盒说明书上并没有明确提到
2.  整个操作过程大概保证在多长时间内完成？因为第一次提，过程很不熟练，我觉得整个操作有点慢
3.  如何能避免基因组DNA污染？第一步裂解细胞试剂盒protocol写充分震荡，怎么掌握强度？过于剧烈会不会造成基因组DNA断裂？
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1楼 2011-12-17 21:24:09
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回帖置顶 ( 共有1个 )

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 热心！专业！经研究授予专家指数一枚！ 2011-12-19 16:42:57
ln031101(金币+5): 太感谢了！ 2011-12-19 21:54:28
1.你如果用类似于硅胶柱过柱的kit，提取过程不用在冰上进行。
2.整个过程（不包括裂解）如果是用kit过柱估计20-30min即可完成。
3.充分振荡不会让DNA断裂，一点点极其微量是有，但不影响结果。

你所说的药物处理几小时肯定会使RNA有所降解。脾脏属于内源性RNase丰富的组织。不过应该也不至于降解成你电泳图那种程度，我觉得你在提取上还有很大可以提高的地方。

1.电泳不用跑那么久，1%的胶约8v/cm电泳20-25min即可。另外上样量最好控制在100-200ng(小孔)[中孔-500ng]左右。
2.试剂盒的方法一般没有作DNA去除的步骤。如果你要得到无DNA污染的RNA你需要提取出来再另作去DNA的处理，如DNase I 消化。
3.试剂盒的优点在于方便及快捷、一般无氯仿抽提，对于新手来说简单，要求不高。但一般没有经过氯仿抽提容易存在DNA污染。
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伟大航线....
6楼2011-12-19 10:44:11
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！！ 2011-12-18 10:59:49
提的效果不佳，点样孔附近很亮，怀疑有DNA污染
1 按说明来，不过我觉得在冰上做比较好
2 肯定是越快越好，但只要你不是慢得离谱，我觉得提取时间只可能影响结果好坏而非有无。
3 DNA污染部分，酚氯仿抽提吸上清这一步，少吸点会有帮助。如果污染仍很严重，可以用无RNA酶活性的DNA酶处理。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2011-12-18 04:36:03
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！！ 2011-12-18 11:01:38
我觉得是不是你样品保存的问题，我不是做动物的。但是取样后应该马上液氮速冻后放负80。不知道你用什么盒子，是否液氮研磨，其他操作一般都要在rt，低温可能导致裂解液效果不佳。
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3楼2011-12-18 08:50:59
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ln031101

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by starseacow at 2011-12-18 04:36:03:
提的效果不佳，点样孔附近很亮，怀疑有DNA污染
1 按说明来，不过我觉得在冰上做比较好
2 肯定是越快越好，但只要你不是慢得离谱，我觉得提取时间只可能影响结果好坏而非有无。
3 DNA污染部分，酚氯仿抽提吸上清 ...

那在泳道前面那部分弥散状的时降解的RNA还是别的什么？？
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4楼2011-12-18 11:01:23
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ln031101

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by shaquila at 2011-12-18 08:50:59:
我觉得是不是你样品保存的问题，我不是做动物的。但是取样后应该马上液氮速冻后放负80。不知道你用什么盒子，是否液氮研磨，其他操作一般都要在rt，低温可能导致裂解液效果不佳。

我是将小鼠脾细胞分离出来，药物处理几个小时，然后提的RNA，不知道在这个过程中对细胞RNA有没有影响？
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5楼2011-12-18 11:02:34
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wanghd2826

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wanhscn(金币+5): 鼓励新虫友积极应助！望再接再励！ 2011-12-19 16:43:39
ln031101(金币+5): 太感谢了！ 2011-12-19 21:55:59
总体来说，效果不佳（不过你第一次提能得到这样的效果已经很不错了），最后两条泳道的用DNA酶处理下还能做一般的RT-PCR，以下是我提RNA的建议和一点经验：
1、整个过程尽量在冰上进行。
2、最好用规划过的枪头和离心管，不是很贵。如果为了省钱，那得用0.1%的DEPC水过夜处理，再高压灭菌，因为DEPC非常危险，所以这点钱最好别省。
3、速度尽量快，但不要心急，因为无论怎样RNA都会降解。
4、研磨是关键，最好用液氮，研磨到细粉状。
5、点样孔很亮，说明有蛋白质污染，可能是在取上清的过程中吸多了，不要贪多，够用即可。
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7楼2011-12-19 15:57:42
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tian1203

银虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！ 2011-12-19 21:56:13
很容易忽略的原因：不是RNA提取的问题；是点样时RNA浓度太高

电泳时RNA浓度不可太高，否则电泳图会出现看似降解的情况

把你的RNA再稀释后电泳试试
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别紧张，我不是什么好人...
8楼2011-12-19 17:02:12
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heroyl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！ 2011-12-19 21:56:25
我觉得吧，电泳图不一定就能反映真实情况，因为难免你在电泳的时候会不会出现什么问题，这也是很重要的。以前我提RNA后跑电泳，效果经常不是很好，可作RT还是没问题的。
    我也经常提动物组织的RNA，一般都是用Trizol提的，组织都是以前冻存的，各个组织都提过，如果提的组织多的话可能要2-3小时，用nanodrop测浓度或260/280都挺好的，做RT-PCR也没问题。
    操作还是要小心的，专用的管子、枪头、匀浆机的转子都是泡过的，提的时候口罩、手套伺候，手套勤换，多喷酒精等等，需要注意的很多。
    祝实验顺利。
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
9楼2011-12-19 17:16:49
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