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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手提RNA，请教几个问题
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ln031101

铜虫 (小有名气)

[求助] 新手提RNA，请教几个问题

小鼠脾细胞，用试剂盒提的RNA，提了两次结果都差不多，所有器皿我都已经处理过了，这是降解的很严重吗？
1，整个提取过程需要在冰上进行吗？试剂盒说明书上并没有明确提到
2.  整个操作过程大概保证在多长时间内完成？因为第一次提，过程很不熟练，我觉得整个操作有点慢
3.  如何能避免基因组DNA污染？第一步裂解细胞试剂盒protocol写充分震荡，怎么掌握强度？过于剧烈会不会造成基因组DNA断裂？
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1楼 2011-12-17 21:24:09
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heroyl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！ 2011-12-19 21:56:25
我觉得吧，电泳图不一定就能反映真实情况，因为难免你在电泳的时候会不会出现什么问题，这也是很重要的。以前我提RNA后跑电泳，效果经常不是很好，可作RT还是没问题的。
    我也经常提动物组织的RNA，一般都是用Trizol提的，组织都是以前冻存的，各个组织都提过，如果提的组织多的话可能要2-3小时，用nanodrop测浓度或260/280都挺好的，做RT-PCR也没问题。
    操作还是要小心的，专用的管子、枪头、匀浆机的转子都是泡过的，提的时候口罩、手套伺候，手套勤换，多喷酒精等等，需要注意的很多。
    祝实验顺利。
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实验虐我千百遍，我待实验如初恋
9楼2011-12-19 17:16:49
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！！ 2011-12-18 10:59:49
提的效果不佳，点样孔附近很亮，怀疑有DNA污染
1 按说明来，不过我觉得在冰上做比较好
2 肯定是越快越好，但只要你不是慢得离谱，我觉得提取时间只可能影响结果好坏而非有无。
3 DNA污染部分，酚氯仿抽提吸上清这一步，少吸点会有帮助。如果污染仍很严重，可以用无RNA酶活性的DNA酶处理。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2011-12-18 04:36:03
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shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
ln031101(金币+3): 谢谢！！ 2011-12-18 11:01:38
我觉得是不是你样品保存的问题，我不是做动物的。但是取样后应该马上液氮速冻后放负80。不知道你用什么盒子，是否液氮研磨，其他操作一般都要在rt，低温可能导致裂解液效果不佳。
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3楼2011-12-18 08:50:59
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ln031101

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by starseacow at 2011-12-18 04:36:03:
提的效果不佳，点样孔附近很亮，怀疑有DNA污染
1 按说明来，不过我觉得在冰上做比较好
2 肯定是越快越好，但只要你不是慢得离谱，我觉得提取时间只可能影响结果好坏而非有无。
3 DNA污染部分，酚氯仿抽提吸上清 ...

那在泳道前面那部分弥散状的时降解的RNA还是别的什么？？
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4楼2011-12-18 11:01:23
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