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新手提RNA，请教几个问题
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小鼠脾细胞，用试剂盒提的RNA，提了两次结果都差不多，所有器皿我都已经处理过了，这是降解的很严重吗？ 1，整个提取过程需要在冰上进行吗？试剂盒说明书上并没有明确提到 2. 整个操作过程大概保证在多长时间内完成？因为第一次提，过程很不熟练，我觉得整个操作有点慢 3. 如何能避免基因组DNA污染？第一步裂解细胞试剂盒protocol写充分震荡，怎么掌握强度？过于剧烈会不会造成基因组DNA断裂？  |
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 实验技术 | 【分子生物】EPI帖 |
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starseacow
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2楼2011-12-18 04:36:03
shaquila
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3楼2011-12-18 08:50:59
4楼2011-12-18 11:01:23
5楼2011-12-18 11:02:34
【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 热心！专业！经研究授予专家指数一枚！ 2011-12-19 16:42:57
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1.你如果用类似于硅胶柱过柱的kit，提取过程不用在冰上进行。 2.整个过程（不包括裂解）如果是用kit过柱估计20-30min即可完成。 3.充分振荡不会让DNA断裂，一点点极其微量是有，但不影响结果。 你所说的药物处理几小时肯定会使RNA有所降解。脾脏属于内源性RNase丰富的组织。不过应该也不至于降解成你电泳图那种程度，我觉得你在提取上还有很大可以提高的地方。 1.电泳不用跑那么久，1%的胶约8v/cm电泳20-25min即可。另外上样量最好控制在100-200ng(小孔)[中孔-500ng]左右。 2.试剂盒的方法一般没有作DNA去除的步骤。如果你要得到无DNA污染的RNA你需要提取出来再另作去DNA的处理，如DNase I 消化。 3.试剂盒的优点在于方便及快捷、一般无氯仿抽提，对于新手来说简单，要求不高。但一般没有经过氯仿抽提容易存在DNA污染。 |
6楼2011-12-19 10:44:11
wanghd2826
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【答案】应助回帖
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总体来说，效果不佳（不过你第一次提能得到这样的效果已经很不错了），最后两条泳道的用DNA酶处理下还能做一般的RT-PCR，以下是我提RNA的建议和一点经验： 1、整个过程尽量在冰上进行。 2、最好用规划过的枪头和离心管，不是很贵。如果为了省钱，那得用0.1%的DEPC水过夜处理，再高压灭菌，因为DEPC非常危险，所以这点钱最好别省。 3、速度尽量快，但不要心急，因为无论怎样RNA都会降解。 4、研磨是关键，最好用液氮，研磨到细粉状。 5、点样孔很亮，说明有蛋白质污染，可能是在取上清的过程中吸多了，不要贪多，够用即可。 |
7楼2011-12-19 15:57:42
8楼2011-12-19 17:02:12
heroyl
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【答案】应助回帖
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ln031101(金币+3): 谢谢！ 2011-12-19 21:56:25
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我觉得吧，电泳图不一定就能反映真实情况，因为难免你在电泳的时候会不会出现什么问题，这也是很重要的。以前我提RNA后跑电泳，效果经常不是很好，可作RT还是没问题的。 我也经常提动物组织的RNA，一般都是用Trizol提的，组织都是以前冻存的，各个组织都提过，如果提的组织多的话可能要2-3小时，用nanodrop测浓度或260/280都挺好的，做RT-PCR也没问题。 操作还是要小心的，专用的管子、枪头、匀浆机的转子都是泡过的，提的时候口罩、手套伺候，手套勤换，多喷酒精等等，需要注意的很多。 祝实验顺利。 |
9楼2011-12-19 17:16:49
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