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新手提RNA，请教几个问题
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小鼠脾细胞，用试剂盒提的RNA，提了两次结果都差不多，所有器皿我都已经处理过了，这是降解的很严重吗？ 1，整个提取过程需要在冰上进行吗？试剂盒说明书上并没有明确提到 2. 整个操作过程大概保证在多长时间内完成？因为第一次提，过程很不熟练，我觉得整个操作有点慢 3. 如何能避免基因组DNA污染？第一步裂解细胞试剂盒protocol写充分震荡，怎么掌握强度？过于剧烈会不会造成基因组DNA断裂？  |
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 实验技术 | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 热心！专业！经研究授予专家指数一枚！ 2011-12-19 16:42:57
ln031101(金币+5): 太感谢了！ 2011-12-19 21:54:28
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wanhscn(金币+2, MolEPI+1): 热心！专业！经研究授予专家指数一枚！ 2011-12-19 16:42:57
ln031101(金币+5): 太感谢了！ 2011-12-19 21:54:28
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1.你如果用类似于硅胶柱过柱的kit，提取过程不用在冰上进行。 2.整个过程（不包括裂解）如果是用kit过柱估计20-30min即可完成。 3.充分振荡不会让DNA断裂，一点点极其微量是有，但不影响结果。 你所说的药物处理几小时肯定会使RNA有所降解。脾脏属于内源性RNase丰富的组织。不过应该也不至于降解成你电泳图那种程度，我觉得你在提取上还有很大可以提高的地方。 1.电泳不用跑那么久，1%的胶约8v/cm电泳20-25min即可。另外上样量最好控制在100-200ng(小孔)[中孔-500ng]左右。 2.试剂盒的方法一般没有作DNA去除的步骤。如果你要得到无DNA污染的RNA你需要提取出来再另作去DNA的处理，如DNase I 消化。 3.试剂盒的优点在于方便及快捷、一般无氯仿抽提，对于新手来说简单，要求不高。但一般没有经过氯仿抽提容易存在DNA污染。 |
6楼2011-12-19 10:44:11
starseacow
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