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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用DNaseⅠ处理RNA中混有的DNA后续操作如何进行？
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zhouxw1987

铁虫 (初入文坛)

[求助] 用DNaseⅠ处理RNA中混有的DNA后续操作如何进行？ 已有1人参与

用Trizol抽提水稻叶片RNA，电泳检测后发现有很多的DNA污染，打算用DNaseⅠ进行处理除去残留的DNA。DNaseⅠ说明书上说的是处理完后可以用RNA纯化试剂盒进行纯化（这个试剂盒实验室没有，所以不用该方法），或者加入一定量的EDTA终止反应并65℃加热10min，但这种方法会有残留有各种离子。现在我想问的是：这个EDTA是如何配制才能保证不含有RNase，同时残留的各种离子是否会对后续的反转录和RT-PCR有影响？？或者可否不用EDTA，而直接将DNaseⅠ处理的RNA溶液80℃处理10min以便去除DNaseⅠ（网上显示该酶在80摄氏度处理10分钟后将永久灭活）。
请问大家是如何处理RNA中混有的DNA呢？？谢谢各位了·····
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1楼 2012-09-16 11:05:22
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验，热心应助 2012-09-17 13:56:02
嗯.................
       是这样的，用EDTA终止法并加热，我们实验室一般不用，因为我们认为若是有一点残留RNAse的话，65度下10min是非常危险的。所以一般灭活法采用酚氯仿抽提两次，然后醇低温沉淀回收RNA。具体使用方法请移步至：
       http://www.takara.com.cn/explain/B/D2270A.pdf
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Let God do with it as He wills
3楼2012-09-16 12:21:40
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普通回帖

gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你买的专门去除DNA的试剂盒里就有啊！
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持之以恒、永不放弃！
2楼2012-09-16 11:17:06
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zhouxw1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-09-16 11:17:06
你买的专门去除DNA的试剂盒里就有啊！

里面没有EDTA，那个貌似要自己配的····
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4楼2012-09-16 15:28:40
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zhouxw1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-16 12:21:40
嗯.................
       是这样的，用EDTA终止法并加热，我们实验室一般不用，因为我们认为若是有一点残留RNAse的话，65度下10min是非常危险的。所以一般灭活法采用酚氯仿抽提两次，然后醇低温沉淀回收RNA。具 ...

我去看看，万分感谢····
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5楼2012-09-16 15:29:28
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zhouxw1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-09-16 12:21:40
嗯.................
       是这样的，用EDTA终止法并加热，我们实验室一般不用，因为我们认为若是有一点残留RNAse的话，65度下10min是非常危险的。所以一般灭活法采用酚氯仿抽提两次，然后醇低温沉淀回收RNA。具 ...

谢谢，不过貌似这里面也有同一个问题，那就是3M的醋酸钠如何配制？？？这个应该也是要无RNase的吧？？？
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6楼2012-09-16 15:36:46
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhouxw1987 at 2012-09-16 15:36:46
谢谢，不过貌似这里面也有同一个问题，那就是3M的醋酸钠如何配制？？？这个应该也是要无RNase的吧？？？...

嗯........................
       肯定需要无RNase的，具体处理应该使用DEPC，你可以问问经常手提RNA的师兄师姐，这个要加多少合适我已经忘了，好久都没做了。
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Let God do with it as He wills
7楼2012-09-16 18:00:47
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272401213

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
据说invitrogen的产品~只要加进去，让消化就好了，消化完直接可以用！无需其他处理！不过貌似有点小贵
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YNWA
8楼2012-09-17 07:38:15
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wanghh_lzu

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
takara上有DNAase的说明书，我们实验室用DEPC水配的EDTA和NaAC   配完灭菌 分装,再根据说明书上的步骤走就可以了 效果一直不错
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9楼2012-09-17 09:56:19
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zhouxw1987

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wanghh_lzu at 2012-09-17 09:56:19
takara上有DNAase的说明书，我们实验室用DEPC水配的EDTA和NaAC   配完灭菌 分装,再根据说明书上的步骤走就可以了 效果一直不错

好吧，谢谢！不过我想问问这个DEPC水，是经过高压处理后的，还是直接新配的？另外NaAC和EDTA高压灭菌后不会对药品本身性质有影响么？？？谢谢·····
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10楼2012-09-17 20:38:19
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