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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒）
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happy8506

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒） 已有4人参与

请教一下用DNase 处理 RNA ，除去DNA的详细步骤，最好是不用试剂盒的。谢谢！
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1楼 2010-05-19 15:41:47
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happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-05-20 18:56:23:
我用的 Takara的DNA酶，效果挺好，但是要反映一个半到两个小时，不过这两天我的实验有点问题，RNA有些降解，DNA除的也不非常干净，就是第一次做得好，我怀疑我的酶还有抑制剂可能活性都不行了啊？

想问下除去DNA后RNA的电泳图应该是怎样的算最好？还有RNA很容易降解，负八十度保存能放多久？
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9楼2010-05-25 10:28:41
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普通回帖

holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★ ★ ★
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lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。
RNA                       10 μg
DEPC水                    n μL
10×DNase I Buffer     2 μL
DNase I                    2 μL
Total volume             20 μL

2）37 ℃，反应10min。

3）加入2μL 1mM EDTA，75 ℃变性10min，冰上冷却。

4）补水至100μL（78μL DEPC–H2O），加入10μL 3M NaAC，2μL糖原，混匀后加入2.5倍体积的无水乙醇，再次混匀，-80 ℃静置30min沉淀RNA，13000 rpm 4 ℃离心20min。70%乙醇（DEPC–H2O配制）洗涤并13000 rpm离心5min。稍微晾干后用DEPC–水溶解沉淀。
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2楼2010-05-19 17:25:04
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:51:58
1、首先要打开RNA 的二级结构。70-72℃10min后立刻冰冷。
2、体系有大有小根据说明书来就可以了。
3、特别注意DNAse的浓度！也就是单位数，一般稀释后使用，1/1000有时候就足够啦。
4、过柱子法或者沉淀法回收RNA，肯定会有不少损失的~多准备点RNA哈~

祝福好运！
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3楼2010-05-19 17:49:12
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happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2010-05-19 17:25:04:
1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。
RNA                       10 μg
DEPC水                    n μL
10×DNase I Buffer     2 μL
DNase I       ...

谢谢，可是一定要加糖原吗？
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4楼2010-05-19 18:15:03
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happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-05-19 17:49:12:
1、首先要打开RNA 的二级结构。70-72℃10min后立刻冰冷。
2、体系有大有小根据说明书来就可以了。
3、特别注意DNAse的浓度！也就是单位数，一般稀释后使用，1/1000有时候就足够啦。
4、过柱子法或者沉淀法回收 ...

谢谢！要用试剂盒的是吧？
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5楼2010-05-19 18:17:12
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★
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引用回帖:
Originally posted by happy8506 at 2010-05-19 18:15:03:


谢谢，可是一定要加糖原吗？

加糖原和醋酸钠是为了帮助沉淀，如果RNA的量比较大，可以不用加。
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6楼2010-05-19 18:27:40
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happy8506

新虫 (初入文坛)
除去 RNA 中的基因组 DNA
1.   在微量离心管中配制下列反应液，全量 50 μl。
全 RNA  20～50  μg   
10×DNase I Buffer                      5  μl   
DNase I（RNase-free，5 U/μl）    2  μl
RNase Inhibitor（40 U/μl）    0.5  μl         
DEPC H2O      up to  50  μl
     
2.  37℃反应 20～30 分钟。
3.  使用以下两种方法使 DNase I 失活。
A．热处理
（1）加入 2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃  2 min。
（2）用 RNase Free dH2O定容至 100 μl。
B．苯酚/氯仿抽提
（1）用 50 μl RNase Free dH2O 定容至 100 μl 后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
混匀。
（2）室温，13,500 rpm 5 min 离心，取上清。
（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。
（4）室温，13,500 rpm 5 min 离心，取上清。
4.  加入 10 μl 3 M 醋酸钠，250 μl 冷乙醇，冰上放置 10 min。
5.  4℃，13,500 rpm 15 min 离心，弃上清。
6.  加入 70%冷乙醇洗净，4℃，13,500 rpm 5 min 离心，弃上清。
7.  沉淀干燥。
8.  用适量的 RNase Free dH2O溶解后，进行Agarose 电泳确认是否除去基因组 DNA。
这是我新查到的，应该可以吧？
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7楼2010-05-20 11:48:27
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linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
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我用的 Takara的DNA酶，效果挺好，但是要反映一个半到两个小时，不过这两天我的实验有点问题，RNA有些降解，DNA除的也不非常干净，就是第一次做得好，我怀疑我的酶还有抑制剂可能活性都不行了啊？
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8楼2010-05-20 18:56:23
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happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2010-05-19 18:27:40:



加糖原和醋酸钠是为了帮助沉淀，如果RNA的量比较大，可以不用加。

请教一下呗，我的RNA提出来OD260/OD280=1.8
这样还用再除下蛋白吗？
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10楼2010-05-25 10:38:13
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