应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒）
131/2返回列表12下一页
查看: 2285  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

happy8506

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒） 已有4人参与

请教一下用DNase 处理 RNA ，除去DNA的详细步骤，最好是不用试剂盒的。谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-05-19 15:41:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-05-20 18:56:23:
我用的 Takara的DNA酶，效果挺好，但是要反映一个半到两个小时，不过这两天我的实验有点问题，RNA有些降解，DNA除的也不非常干净，就是第一次做得好，我怀疑我的酶还有抑制剂可能活性都不行了啊？

想问下除去DNA后RNA的电泳图应该是怎样的算最好？还有RNA很容易降解，负八十度保存能放多久？
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2010-05-25 10:28:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。
RNA                       10 μg
DEPC水                    n μL
10×DNase I Buffer     2 μL
DNase I                    2 μL
Total volume             20 μL

2）37 ℃，反应10min。

3）加入2μL 1mM EDTA，75 ℃变性10min，冰上冷却。

4）补水至100μL（78μL DEPC–H2O），加入10μL 3M NaAC，2μL糖原，混匀后加入2.5倍体积的无水乙醇，再次混匀，-80 ℃静置30min沉淀RNA，13000 rpm 4 ℃离心20min。70%乙醇（DEPC–H2O配制）洗涤并13000 rpm离心5min。稍微晾干后用DEPC–水溶解沉淀。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-05-19 17:25:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:51:58
1、首先要打开RNA 的二级结构。70-72℃10min后立刻冰冷。
2、体系有大有小根据说明书来就可以了。
3、特别注意DNAse的浓度！也就是单位数，一般稀释后使用，1/1000有时候就足够啦。
4、过柱子法或者沉淀法回收RNA，肯定会有不少损失的~多准备点RNA哈~

祝福好运！
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-05-19 17:49:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2010-05-19 17:25:04:
1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。
RNA                       10 μg
DEPC水                    n μL
10×DNase I Buffer     2 μL
DNase I       ...

谢谢，可是一定要加糖原吗？
赞一下 回复此楼
4楼2010-05-19 18:15:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhwenxing at 2010-05-19 17:49:12:
1、首先要打开RNA 的二级结构。70-72℃10min后立刻冰冷。
2、体系有大有小根据说明书来就可以了。
3、特别注意DNAse的浓度！也就是单位数，一般稀释后使用，1/1000有时候就足够啦。
4、过柱子法或者沉淀法回收 ...

谢谢！要用试剂盒的是吧？
赞一下 回复此楼
5楼2010-05-19 18:17:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by happy8506 at 2010-05-19 18:15:03:


谢谢，可是一定要加糖原吗？

加糖原和醋酸钠是为了帮助沉淀，如果RNA的量比较大，可以不用加。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-05-19 18:27:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy8506

新虫 (初入文坛)
除去 RNA 中的基因组 DNA
1.   在微量离心管中配制下列反应液，全量 50 μl。
全 RNA  20～50  μg   
10×DNase I Buffer                      5  μl   
DNase I（RNase-free，5 U/μl）    2  μl
RNase Inhibitor（40 U/μl）    0.5  μl         
DEPC H2O      up to  50  μl
     
2.  37℃反应 20～30 分钟。
3.  使用以下两种方法使 DNase I 失活。
A．热处理
（1）加入 2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃  2 min。
（2）用 RNase Free dH2O定容至 100 μl。
B．苯酚/氯仿抽提
（1）用 50 μl RNase Free dH2O 定容至 100 μl 后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）
混匀。
（2）室温，13,500 rpm 5 min 离心，取上清。
（3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。
（4）室温，13,500 rpm 5 min 离心，取上清。
4.  加入 10 μl 3 M 醋酸钠，250 μl 冷乙醇，冰上放置 10 min。
5.  4℃，13,500 rpm 15 min 离心，弃上清。
6.  加入 70%冷乙醇洗净，4℃，13,500 rpm 5 min 离心，弃上清。
7.  沉淀干燥。
8.  用适量的 RNase Free dH2O溶解后，进行Agarose 电泳确认是否除去基因组 DNA。
这是我新查到的，应该可以吧？
赞一下 回复此楼
7楼2010-05-20 11:48:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linxi8579

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我用的 Takara的DNA酶，效果挺好，但是要反映一个半到两个小时，不过这两天我的实验有点问题，RNA有些降解，DNA除的也不非常干净，就是第一次做得好，我怀疑我的酶还有抑制剂可能活性都不行了啊？
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2010-05-20 18:56:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2010-05-19 18:27:40:



加糖原和醋酸钠是为了帮助沉淀，如果RNA的量比较大，可以不用加。

请教一下呗，我的RNA提出来OD260/OD280=1.8
这样还用再除下蛋白吗？
赞一下 回复此楼
10楼2010-05-25 10:38:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 happy8506 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 295分求调剂 +6 ?要上岸? 2026-04-17 6/300 2026-04-21 08:18 by Equinoxhua
[考研] 一志愿中科大材料与化工，353分还有调剂学校吗 +11 否极泰来2026 2026-04-15 13/650 2026-04-20 22:31 by Equinoxhua
[考研] 320求调剂 +6 深郊akm 2026-04-17 6/300 2026-04-20 18:57 by fs26jie
[论文投稿] 期刊推荐 +3 材料研究生 2026-04-15 5/250 2026-04-20 16:02 by 豆豆7758
[论文投稿] 有没有接收比较快的sci期刊呀，最好在一个月之内的，研三孩子求毕业 20+4 之护着 2026-04-16 7/350 2026-04-20 15:45 by 豆豆7758
[教师之家] 又一批高校组建人工智能学院 师资行吗 不是骗人吗 +4 yexuqing 2026-04-19 4/200 2026-04-20 14:47 by brantleo
[考研] 337求调剂 +3 jyz04 2026-04-18 3/150 2026-04-20 12:24 by 研可安
[考博] 申博/考博 +4 啃面包的小书虫 2026-04-17 5/250 2026-04-20 10:47 by YuY66
[考博] 湖南大学刘巧玲课题组2026年第二批次博士研究生招生信息 +3 南风观火 2026-04-18 5/250 2026-04-20 10:13 by 南风观火
[考研] 求计算机方向调剂 +3 Toffee2 2026-04-16 6/300 2026-04-19 22:37 by ll叶
[考研] 297，工科调剂? +11 河南农业大学-能 2026-04-14 11/550 2026-04-19 20:07 by Equinoxhua
[考研] 294求调剂 +8 淡然654321 2026-04-17 9/450 2026-04-19 19:51 by Equinoxhua
[考研] 304求调剂 +8 castLight 2026-04-16 8/400 2026-04-19 17:14 by 中豫男
[考研] 291求调剂 +12 关忆北. 2026-04-14 13/650 2026-04-19 16:50 by 中豫男
[考研] 求调剂 +6 苦命人。。。 2026-04-18 7/350 2026-04-19 16:27 by 中豫男
[考研] 294求调剂 +15 淡然654321 2026-04-15 15/750 2026-04-19 08:20 by cuisz
[考研] 297，工科调剂? +5 河南农业大学-能 2026-04-14 5/250 2026-04-18 15:17 by Equinoxhua
[考研] 322求调剂 +6 tekuzu 2026-04-17 6/300 2026-04-17 13:48 by Espannnnnol
[考研] 一志愿沪9，生物学326求调剂 +9 刘墨墨 2026-04-15 9/450 2026-04-16 17:14 by 崔崔崔cccc
[考研] 药学求调剂 +14 喽哈加油 2026-04-14 16/800 2026-04-16 10:15 by beilsong20
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭