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[交流]
【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒） 已有4人参与
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| 请教一下用DNase 处理 RNA ，除去DNA的详细步骤，最好是不用试剂盒的。谢谢！ |
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除去 RNA 中的基因组 DNA 1. 在微量离心管中配制下列反应液，全量 50 μl。 全 RNA 20～50 μg 10×DNase I Buffer 5 μl DNase I（RNase-free，5 U/μl） 2 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.5 μl DEPC H2O up to 50 μl 2. 37℃反应 20～30 分钟。 3. 使用以下两种方法使 DNase I 失活。 A．热处理 （1）加入 2.5 μl 0.5 M EDTA 80℃ 2 min。 （2）用 RNase Free dH2O定容至 100 μl。 B．苯酚/氯仿抽提 （1）用 50 μl RNase Free dH2O 定容至 100 μl 后加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1） 混匀。 （2）室温，13,500 rpm 5 min 离心，取上清。 （3）加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）混匀。 （4）室温，13,500 rpm 5 min 离心，取上清。 4. 加入 10 μl 3 M 醋酸钠，250 μl 冷乙醇，冰上放置 10 min。 5. 4℃，13,500 rpm 15 min 离心，弃上清。 6. 加入 70%冷乙醇洗净，4℃，13,500 rpm 5 min 离心，弃上清。 7. 沉淀干燥。 8. 用适量的 RNase Free dH2O溶解后，进行Agarose 电泳确认是否除去基因组 DNA。 这是我新查到的，应该可以吧？ |
7楼2010-05-20 11:48:27
holyala
木虫 (著名写手)
砖家
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
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1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。 RNA 10 μg DEPC水 n μL 10×DNase I Buffer 2 μL DNase I 2 μL Total volume 20 μL 2）37 ℃，反应10min。 3）加入2μL 1mM EDTA，75 ℃变性10min，冰上冷却。 4）补水至100μL（78μL DEPC–H2O），加入10μL 3M NaAC，2μL糖原，混匀后加入2.5倍体积的无水乙醇，再次混匀，-80 ℃静置30min沉淀RNA，13000 rpm 4 ℃离心20min。70%乙醇（DEPC–H2O配制）洗涤并13000 rpm离心5min。稍微晾干后用DEPC–水溶解沉淀。 |
2楼2010-05-19 17:25:04
zhwenxing
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3楼2010-05-19 17:49:12
4楼2010-05-19 18:15:03
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