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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒）
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happy8506

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】DNase 处理 RNA 的具体步骤（不用试剂盒） 已有4人参与

请教一下用DNase 处理 RNA ，除去DNA的详细步骤，最好是不用试剂盒的。谢谢！
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1楼 2010-05-19 15:41:47
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happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by linxi8579 at 2010-05-20 18:56:23:
我用的 Takara的DNA酶，效果挺好，但是要反映一个半到两个小时，不过这两天我的实验有点问题，RNA有些降解，DNA除的也不非常干净，就是第一次做得好，我怀疑我的酶还有抑制剂可能活性都不行了啊？

想问下除去DNA后RNA的电泳图应该是怎样的算最好？还有RNA很容易降解，负八十度保存能放多久？
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9楼2010-05-25 10:28:41
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holyala

木虫 (著名写手)

砖家
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:52:29
1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。
RNA                       10 μg
DEPC水                    n μL
10×DNase I Buffer     2 μL
DNase I                    2 μL
Total volume             20 μL

2）37 ℃，反应10min。

3）加入2μL 1mM EDTA，75 ℃变性10min，冰上冷却。

4）补水至100μL（78μL DEPC–H2O），加入10μL 3M NaAC，2μL糖原，混匀后加入2.5倍体积的无水乙醇，再次混匀，-80 ℃静置30min沉淀RNA，13000 rpm 4 ℃离心20min。70%乙醇（DEPC–H2O配制）洗涤并13000 rpm离心5min。稍微晾干后用DEPC–水溶解沉淀。
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2楼2010-05-19 17:25:04
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 18:51:58
1、首先要打开RNA 的二级结构。70-72℃10min后立刻冰冷。
2、体系有大有小根据说明书来就可以了。
3、特别注意DNAse的浓度！也就是单位数，一般稀释后使用，1/1000有时候就足够啦。
4、过柱子法或者沉淀法回收RNA，肯定会有不少损失的~多准备点RNA哈~

祝福好运！
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3楼2010-05-19 17:49:12
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happy8506

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by holyala at 2010-05-19 17:25:04:
1) 取10μgRNA样品置于RNase–free的EP管中，进行DNA消化。一般采用20μL体系。
RNA                       10 μg
DEPC水                    n μL
10×DNase I Buffer     2 μL
DNase I       ...

谢谢，可是一定要加糖原吗？
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4楼2010-05-19 18:15:03
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