应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题
131/2返回列表12下一页
查看: 6790  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小妞116

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题 已有2人参与

从细胞中提取的RNA,逆转录后PCR，没有转染质粒的细胞也总是可以扩增出我的目的条带，这是什么原因？
还有就是通过DNase1 可以去除基因组DNA吗？去除后可以直接逆转录吗，还是得纯化后逆转录，那TAKARA的说明书实在是太复杂了。貌似第三步去除了基因组DNA后，第四步又开始了纯化，实在是没明白，求助大侠帮忙啊！！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-16 17:46:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有2个 )

sweetbobo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:12:20
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:15:10
不知道你的RNA是不是做realtime PCR，一般情况是，为了防止基因组被扩增，第一要去除RNA中的DNA,就是你正常抽出RNA，加入DNaseI和RNA抑制剂，同时处理后，就再重新加入RNAiso再抽提一轮就可以；第二在设计引物的时候要跨内含子设计，该内含子长度一般要超过1Kb，不然也会有非特异性扩增。不知道你是不是这样的
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-16 20:14:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小妞116: 金币+2, ★有帮助 2013-05-20 09:23:39
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-20 12:32:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:13:26
gyesang: 取消置顶 2013-05-20 16:16:38
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:16:46
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有些公司的可以稍为加热灭活，有的公司加入一些失活剂，或者重新抽提一次。
向实验室做过此类实验的师兄师姐取取经...
赞一下 回复此楼
伟大航线....
5楼2013-05-20 09:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:11:57
楼主的试剂有污染, 或者取样的时候样品交叉污染, 这是首要问题.
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-16 17:55:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飞天36

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小妞116: 金币+2, ★有帮助 2013-05-20 09:20:16
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 75%酒精洗涤的目的是去盐，DNA是去除不了的 2013-05-20 16:13:08
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA
赞一下 回复此楼
生活很多不如意，现在想给变
4楼2013-05-20 08:43:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞天36 at 2013-05-20 08:43:56
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA

我的目的基因处有条带的。。。。就是没有转染的细胞提的RNA也P出了我的目的条带。。。
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-20 09:19:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 09:12:12
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有 ...

可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一个做过的师兄说他一般都没有去除的。所以我就纠结了。。。并且去除的过程好复杂的说啊。。
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-20 09:23:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:13:57
去除DNA的过程当然很复杂，也很损失RNA，但是，你去除不干净，影响后续试验。第一，确认你的试剂没有污染，就是做个阴性对照。第二，确认你的gDNA纯化完全了。
赞一下 回复此楼
8楼2013-05-20 09:55:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)
★
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:14:19
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小妞116 at 2013-05-20 09:23:28
可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一 ...

不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？
赞一下 回复此楼
伟大航线....
9楼2013-05-20 15:53:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 15:53:58
不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？...

可是那怎么验证啊，琼脂糖凝胶？
赞一下 回复此楼
10楼2013-05-20 17:52:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小妞116 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0703化学调剂 290分有科研经历，论文在投 +3 腻腻gk 2026-03-14 3/150 2026-03-15 17:28 by 小物理化学
[考研] 294求调剂 +3 Zys010410@ 2026-03-13 4/200 2026-03-15 10:59 by zhq0425
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 085600材料与化工 326 求调剂 +5 热爱生活ing 2026-03-09 5/250 2026-03-14 02:39 by JourneyLucky
[考研] 求调剂！ +4 朔朔话 2026-03-09 4/200 2026-03-14 01:38 by JourneyLucky
[考研] 085600求调剂 +3 a邵星池 2026-03-09 3/150 2026-03-14 01:32 by JourneyLucky
[考研] 复试调剂 +9 Copy267 2026-03-10 9/450 2026-03-13 23:45 by userper
[考研] 材料371求调剂 +9 鳄鱼? 2026-03-11 11/550 2026-03-13 22:53 by JourneyLucky
[考研] 281求调剂 +9 Koxui 2026-03-12 11/550 2026-03-13 20:50 by Koxui
[论文投稿] 投稿问题 5+4 星光灿烂xt 2026-03-12 6/300 2026-03-13 14:17 by god_tian
[考研] 26考研求调剂 +5 丶宏Sir 2026-03-13 5/250 2026-03-13 13:05 by JourneyLucky
[考研] 277求调剂 +4 anchor17 2026-03-12 4/200 2026-03-13 11:15 by 白夜悠长
[考研] 0817化学工程与技术考研312分调剂 +3 T123 tt 2026-03-12 3/150 2026-03-13 10:49 by houyaoxu
[考研] 08食品或轻工求调剂，本科发表3篇sci一区top论文，一志愿南师大食品科学与工程 +3 我是一个兵， 2026-03-10 3/150 2026-03-13 10:21 by Yuyi.
[考研] 283求调剂，材料、化工皆可 +8 苏打水7777 2026-03-11 10/500 2026-03-13 09:06 by Linda Hu
[考博] 26读博 +4 Rui135246 2026-03-12 10/500 2026-03-13 07:15 by gaobiao
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-12 4/200 2026-03-12 19:33 by 求调剂zz
[考博] 2026年博士申请 +3 QwQwQW10 2026-03-11 3/150 2026-03-12 17:58 by gxch43
[考博] 26申博求助 +3 跳跃饼干 2026-03-10 4/200 2026-03-10 21:15 by Tntcnn
[硕博家园] 木虫好像不热闹了，是不是？ +4 偏振片 2026-03-10 4/200 2026-03-10 09:51 by longwave
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭