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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题
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小妞116

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题 已有2人参与

从细胞中提取的RNA,逆转录后PCR，没有转染质粒的细胞也总是可以扩增出我的目的条带，这是什么原因？
还有就是通过DNase1 可以去除基因组DNA吗？去除后可以直接逆转录吗，还是得纯化后逆转录，那TAKARA的说明书实在是太复杂了。貌似第三步去除了基因组DNA后，第四步又开始了纯化，实在是没明白，求助大侠帮忙啊！！！
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1楼 2013-05-16 17:46:52
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小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞天36 at 2013-05-20 08:43:56
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA

我的目的基因处有条带的。。。。就是没有转染的细胞提的RNA也P出了我的目的条带。。。
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6楼2013-05-20 09:19:50
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小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 09:12:12
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有 ...

可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一个做过的师兄说他一般都没有去除的。所以我就纠结了。。。并且去除的过程好复杂的说啊。。
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7楼2013-05-20 09:23:28
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小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 15:53:58
不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？...

可是那怎么验证啊，琼脂糖凝胶？
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10楼2013-05-20 17:52:00
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