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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题
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小妞116

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题已有2人参与

从细胞中提取的RNA,逆转录后PCR，没有转染质粒的细胞也总是可以扩增出我的目的条带，这是什么原因？
还有就是通过DNase1 可以去除基因组DNA吗？去除后可以直接逆转录吗，还是得纯化后逆转录，那TAKARA的说明书实在是太复杂了。貌似第三步去除了基因组DNA后，第四步又开始了纯化，实在是没明白，求助大侠帮忙啊！！！
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1楼2013-05-16 17:46:52
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:11:57
楼主的试剂有污染, 或者取样的时候样品交叉污染, 这是首要问题.
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2楼2013-05-16 17:55:47
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sweetbobo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:12:20
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:15:10
不知道你的RNA是不是做realtime PCR，一般情况是，为了防止基因组被扩增，第一要去除RNA中的DNA,就是你正常抽出RNA，加入DNaseI和RNA抑制剂，同时处理后，就再重新加入RNAiso再抽提一轮就可以；第二在设计引物的时候要跨内含子设计，该内含子长度一般要超过1Kb，不然也会有非特异性扩增。不知道你是不是这样的
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3楼2013-05-16 20:14:50
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飞天36

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小妞116: 金币+2, ★有帮助 2013-05-20 09:20:16
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 75%酒精洗涤的目的是去盐，DNA是去除不了的 2013-05-20 16:13:08
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA
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生活很多不如意，现在想给变
4楼2013-05-20 08:43:56
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小妞116: 金币+2, ★有帮助 2013-05-20 09:23:39
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-20 12:32:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:13:26
gyesang: 取消置顶 2013-05-20 16:16:38
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:16:46
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有些公司的可以稍为加热灭活，有的公司加入一些失活剂，或者重新抽提一次。
向实验室做过此类实验的师兄师姐取取经...
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伟大航线....
5楼2013-05-20 09:12:12
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小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞天36 at 2013-05-20 08:43:56
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA

我的目的基因处有条带的。。。。就是没有转染的细胞提的RNA也P出了我的目的条带。。。
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6楼2013-05-20 09:19:50
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小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 09:12:12
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有 ...

可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一个做过的师兄说他一般都没有去除的。所以我就纠结了。。。并且去除的过程好复杂的说啊。。
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7楼2013-05-20 09:23:28
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wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:13:57
去除DNA的过程当然很复杂，也很损失RNA，但是，你去除不干净，影响后续试验。第一，确认你的试剂没有污染，就是做个阴性对照。第二，确认你的gDNA纯化完全了。
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8楼2013-05-20 09:55:01
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longrna

新虫 (正式写手)
★
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:14:19
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小妞116 at 2013-05-20 09:23:28
可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一 ...

不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？
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伟大航线....
9楼2013-05-20 15:53:58
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小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 15:53:58
不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？...

可是那怎么验证啊，琼脂糖凝胶？
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10楼2013-05-20 17:52:00
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