应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题
131/2返回列表12下一页
查看: 6796  |  回复: 12
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小妞116

铜虫 (小有名气)

[求助] 关于DNase1 去除提取的RNA中基因组DNA的问题 已有2人参与

从细胞中提取的RNA,逆转录后PCR，没有转染质粒的细胞也总是可以扩增出我的目的条带，这是什么原因？
还有就是通过DNase1 可以去除基因组DNA吗？去除后可以直接逆转录吗，还是得纯化后逆转录，那TAKARA的说明书实在是太复杂了。貌似第三步去除了基因组DNA后，第四步又开始了纯化，实在是没明白，求助大侠帮忙啊！！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-05-16 17:46:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:11:57
楼主的试剂有污染, 或者取样的时候样品交叉污染, 这是首要问题.
赞一下 回复此楼
2楼2013-05-16 17:55:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sweetbobo

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小妞116(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:12:20
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:15:10
不知道你的RNA是不是做realtime PCR，一般情况是，为了防止基因组被扩增，第一要去除RNA中的DNA,就是你正常抽出RNA，加入DNaseI和RNA抑制剂，同时处理后，就再重新加入RNAiso再抽提一轮就可以；第二在设计引物的时候要跨内含子设计，该内含子长度一般要超过1Kb，不然也会有非特异性扩增。不知道你是不是这样的
赞一下 回复此楼
3楼2013-05-16 20:14:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飞天36

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
小妞116: 金币+2, ★有帮助 2013-05-20 09:20:16
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 75%酒精洗涤的目的是去盐，DNA是去除不了的 2013-05-20 16:13:08
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA
赞一下 回复此楼
生活很多不如意，现在想给变
4楼2013-05-20 08:43:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
小妞116: 金币+2, ★有帮助 2013-05-20 09:23:39
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-05-20 12:32:31
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:13:26
gyesang: 取消置顶 2013-05-20 16:16:38
gyesang: 回帖置顶 2013-05-20 16:16:46
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有些公司的可以稍为加热灭活，有的公司加入一些失活剂，或者重新抽提一次。
向实验室做过此类实验的师兄师姐取取经...
赞一下 回复此楼
伟大航线....
5楼2013-05-20 09:12:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 飞天36 at 2013-05-20 08:43:56
你传染的细胞是否表达，你要的目的基因，没有的话，你的引物设计的特异性差。就是污染了吧
我们提取时直接用75%酒精洗涤，去除DNA

我的目的基因处有条带的。。。。就是没有转染的细胞提的RNA也P出了我的目的条带。。。
赞一下 回复此楼
6楼2013-05-20 09:19:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 09:12:12
提取的RNA没有经过DNase I消化的话肯定会有gDNA残留的。
进行DNase I 消化后，是直接进行反转录或是再重新纯化这取决于你的DNase I kit。
但进行灭活剩余的DNase I 是必须的，否则会将反转录合成的DNA也酶切掉。有 ...

可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一个做过的师兄说他一般都没有去除的。所以我就纠结了。。。并且去除的过程好复杂的说啊。。
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-20 09:23:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangqi1107

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:13:57
去除DNA的过程当然很复杂，也很损失RNA，但是，你去除不干净，影响后续试验。第一，确认你的试剂没有污染，就是做个阴性对照。第二，确认你的gDNA纯化完全了。
赞一下 回复此楼
8楼2013-05-20 09:55:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

longrna

新虫 (正式写手)
★
小妞116(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-20 16:14:19
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小妞116 at 2013-05-20 09:23:28
可是验证你的gDNA是否完全的去除的话，是测定提取的RNA的OD260/280的，我提取的RNA，没有去除DNA，OD比值也在1.8~2.2之间的啊，如果这样的话，我再去除一次，我怎么验证呢？而且貌似会损失很多RNA的吧。我实验室一 ...

不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？
赞一下 回复此楼
伟大航线....
9楼2013-05-20 15:53:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小妞116

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by longrna at 2013-05-20 15:53:58
不能用测OD来检验是否提取产物里有没有gDNA.
gDNA 与RNA均为核酸，在260处都有吸光值，紫外分光光度计怎么区分得开呢？...

可是那怎么验证啊，琼脂糖凝胶？
赞一下 回复此楼
10楼2013-05-20 17:52:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小妞116 的主题更新
131/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0817 化学工程 299分求调剂 有科研经历 有二区文章 +3 rare12345 2026-03-18 3/150 2026-03-18 11:58 by djl2006
[考研] 290求调剂 +10 ADT 2026-03-11 10/500 2026-03-18 11:00 by 哦哦123
[考研] 0703化学求调剂 总分331 +3 ZY-05 2026-03-13 3/150 2026-03-18 10:58 by macy2011
[考研] 化学工程321分求调剂 +13 大米饭！ 2026-03-15 16/800 2026-03-18 09:48 by zhukairuo
[考研] 302求调剂 +9 呼呼呼。。。。 2026-03-17 9/450 2026-03-18 09:34 by zhukairuo
[考研] 278求调剂 +5 烟火先于春 2026-03-17 5/250 2026-03-18 08:43 by 星空星月
[考研] 334求调剂 +3 志存高远意在机� 2026-03-16 3/150 2026-03-18 08:34 by lm4875102
[考研] 341求调剂 +5 捣蛋猪猪 2026-03-11 7/350 2026-03-17 19:09 by 捣蛋猪猪
[考研] 344求调剂 +4 knight344 2026-03-16 4/200 2026-03-17 17:27 by ruiyingmiao
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 20:51 by 元子^0^
[考研] 304求调剂 +4 ahbd 2026-03-14 4/200 2026-03-16 16:48 by 我的船我的海
[考研] 311求调剂 +5 26研0 2026-03-15 5/250 2026-03-16 16:21 by a不易
[考研] 中科院材料273求调剂 +4 yzydy 2026-03-15 4/200 2026-03-16 15:59 by Gaodh_82
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 工科，求调剂 +3 我887 2026-03-11 3/150 2026-03-13 21:39 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工085600调剂求老师收留 +9 jiaanl 2026-03-11 9/450 2026-03-13 20:22 by JourneyLucky
[考研] 求b区学校调剂 +3 周56 2026-03-11 3/150 2026-03-13 16:20 by JourneyLucky
[考研] 274求调剂 +3 S.H1 2026-03-12 3/150 2026-03-13 15:15 by JourneyLucky
[考研] 289求调剂 +3 李政莹 2026-03-12 3/150 2026-03-13 11:02 by 求调剂zz
[考博] 福州大学杨黄浩课题组招收2026年专业学位博士研究生，2026.03.20截止 +3 Xiangyu_ou 2026-03-12 3/150 2026-03-13 09:36 by duanwu655
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭