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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录前 DNA 酶消化
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fmtzhangli

金虫 (小有名气)

[求助] 反转录前 DNA 酶消化

我克隆一段基因大约1800bp，先提取了RNA,RT-PCR测序后，发现含有内含子，可能是DNA污染了，打算用DNA酶消化一下，有没有哪位同学做过类似的实验，具体应该怎么做啊，消化后能不能RNA也降解了？请高手指点~

[ Last edited by fmtzhangli on 2012-5-31 at 11:43 ]
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1楼2012-05-31 11:36:23
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-31 13:47:01
加1～2ul 的RNase-free DNase，37度消化5～15分钟（根据你DNA的量的多少），时间不要太长，否则容易RNA也降解了。有条件可以过柱子回收RNA，或者用酚氯仿抽提2遍，基本也可以把蛋白去尽。
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2楼2012-05-31 11:55:39
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qdlinxiaofei

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-31 17:13:27
我用的的是生工的试剂盒，不是很贵，很简单 将你的DNARNA提取物融到42.75ul DEPC灭菌水里 然后加2ulDNase 5UL BUFFER  0.25 RNA酶抑制剂（40U/UL）37度 半个小时  我做了十几次了 这份方法就失败了一次
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3楼2012-05-31 15:44:40
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fmtzhangli

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qdlinxiaofei at 2012-05-31 15:44:40
我用的的是生工的试剂盒，不是很贵，很简单 将你的DNARNA提取物融到42.75ul DEPC灭菌水里 然后加2ulDNase 5UL BUFFER  0.25 RNA酶抑制剂（40U/UL）37度 半个小时  我做了十几次了 这份方法就失败了一次

这样做完是不是还要让DNA酶失活啊？怎么做呢？
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4楼2012-06-01 15:23:17
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们做荧光定量的，消化基因组DNA是50ul体系中加入5ul DNAse1,37度30min，然后加入5ulEDTA，65度10min。一般不会让RNA降解很多的，只要你的水是RNAse free的，操作也规范，损失不会太大。
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一切都要靠自己努力
5楼2012-06-01 20:16:19
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longrna

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基本上大的生物公司如life(AB\ambion\invitrogen)、Thermo(farmentas等)、Qiagen等都有用于消化去除RNA中的DNA的DNase I。用法及灭活在protocol里都有写，一般是加热灭活或再用酚氯仿再抽提一次。
此步操作需要非常严谨，严防RNase污染，否则到DNA消化完了发现RNA也没了。
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伟大航线....
6楼2012-06-02 10:23:26
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fmtzhangli

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2012-06-02 10:23:26
基本上大的生物公司如life(AB\ambion\invitrogen)、Thermo(farmentas等)、Qiagen等都有用于消化去除RNA中的DNA的DNase I。用法及灭活在protocol里都有写，一般是加热灭活或再用酚氯仿再抽提一次。
此步操作需要非常 ...

谢谢回复，请问灭活时是只用其中一个方法还是两个都要用？这两个方法哪个效果能好点
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7楼2012-06-02 12:25:41
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longrna

新虫 (正式写手)
用其中一种即可。
目前没看到有人说用哪一种方法更好的说法。不过可能大部分人会采用热失活的方法，简单，损失少。但酚氯仿再抽一次也有人用。
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伟大航线....
8楼2012-06-02 14:00:02
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wansanlian

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
6楼: Originally posted by longrna at 2012-06-02 10:23:26
基本上大的生物公司如life(AB\ambion\invitrogen)、Thermo(farmentas等)、Qiagen等都有用于消化去除RNA中的DNA的DNase I。用法及灭活在protocol里都有写，一般是加热灭活或再用酚氯仿再抽提一次。
此步操作需要非常 ...

我还经常消化完也没有了。有的时候用核酸共沉的时候也发现共沉之后RNA全没有了。用的还是宝生物的呢~
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乱花渐欲迷人眼
9楼2012-06-03 08:52:02
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ma_xiaowen

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

最近也遇到这种情况 用cDNA作模板克隆得到的序列里含有内含子 头疼啊 还得重新提RNA消解 再合成cDNA吧
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10楼2013-04-27 15:12:35
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