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fmtzhangli

金虫 (小有名气)

[求助] 反转录前 DNA 酶消化

我克隆一段基因大约1800bp,先提取了RNA,RT-PCR测序后,发现含有内含子,可能是DNA污染了,打算用DNA酶消化一下,有没有哪位同学做过类似的实验,具体应该怎么做啊,消化后能不能RNA也降解了?请高手指点~

[ Last edited by fmtzhangli on 2012-5-31 at 11:43 ]
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qdlinxiaofei

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-31 17:13:27
我用的的是生工的试剂盒,不是很贵,很简单 将你的DNARNA提取物融到42.75ul DEPC灭菌水里 然后加2ulDNase 5UL BUFFER  0.25 RNA酶抑制剂(40U/UL)37度 半个小时  我做了十几次了 这份方法就失败了一次
3楼2012-05-31 15:44:40
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-05-31 13:47:01
加1~2ul 的RNase-free DNase,37度消化5~15分钟(根据你DNA的量的多少),时间不要太长,否则容易RNA也降解了。有条件可以过柱子回收RNA,或者用酚氯仿抽提2遍,基本也可以把蛋白去尽。
2楼2012-05-31 11:55:39
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fmtzhangli

金虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by qdlinxiaofei at 2012-05-31 15:44:40
我用的的是生工的试剂盒,不是很贵,很简单 将你的DNARNA提取物融到42.75ul DEPC灭菌水里 然后加2ulDNase 5UL BUFFER  0.25 RNA酶抑制剂(40U/UL)37度 半个小时  我做了十几次了 这份方法就失败了一次

这样做完是不是还要让DNA酶失活啊?怎么做呢?
4楼2012-06-01 15:23:17
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xiayongxiu

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们做荧光定量的,消化基因组DNA是50ul体系中加入5ul DNAse1,37度30min,然后加入5ulEDTA,65度10min。一般不会让RNA降解很多的,只要你的水是RNAse free的,操作也规范,损失不会太大。
一切都要靠自己努力
5楼2012-06-01 20:16:19
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