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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母转化验证方法
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

[交流] 酵母转化验证方法 已有5人参与

一般质粒转入酵母后，要怎样验证是否成功转入呢？质粒上插入的片段在基因组上也有，而且转入后也以质粒形式存在的。
都要提取质粒的话，工作量确实挺大的。而且我提取质粒后做PCR，虽然有条带，但是条带大小不对啊。。。，有的去测序，结果和基因组上的某个基因是一样的（质粒上的启动子是该基因的），郁闷啊。。。不知道是什么原因
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1楼 2013-07-16 21:12:37
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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2楼: Originally posted by 肃清华书 at 2013-07-16 21:52:57
可以选择培养基里面进行培养，你提取PCR条带怎么能不对呢。。估计是产物的浓度小了所以提取看不到吧。。

是在选择培养基上培养的。条带位置确实不对，而且还挺亮的 呢。。。
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4楼2013-07-17 00:13:11
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-16 23:19:00
最靠谱的方法就是把质粒提取出来测序。

浓度可能比较低或者什么原因吧，转入大肠都不长
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5楼2013-07-17 00:13:41
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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6楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-07-17 09:32:46
你的目的基因在质粒和基因组上都有，有可能在你转化的时候，质粒上的基因与基因组上的基因重组了

理论上讲，是有这个可能。但是PCR的条带大小及测序结果都说明不是啊，就是基因组上的另一个基因。。。
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7楼2013-07-17 10:04:03
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by heroxuning at 2013-07-18 09:05:18
设计特殊PCR引物，可以避免和基因组的相似片段混淆。

做个类似这样的实验，姑且先把质粒上启动子的基因称为A，插入的 目的基因称为B。试着用A的上游引物和B的下游引物做PCR，可是出现了一个更神奇的事情————转入的构建好的载体PCR条带位置正确，但是转入的原有质粒，即未插入B基因的质粒，PCR条带居然和它一样！！！真是百思不得其解。。。。
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10楼2013-07-18 09:46:16
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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12楼2013-07-18 12:18:19
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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13楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-19 01:37:49
如果你的载体构建后通过测序没有问题，那么就肯定没有问题了，现在就检测你的载体是否成功转入。在此，首先你转化的时候记得做阴性对照（1 不加入载体，2 加入空载（该对照对于你将来蛋白表达的时候也是需要的）） ...

嗯，这两个对照都有的。不过不加载体的不是同时做的，是之前探索抗生素浓度时做的。后来转化的就涂布在不加载体的菌株不生长的浓度下，然后挑的菌。质粒做PCR，不过没有提取基因组呢，这个是必须的吗？谢谢
    另外，你睡觉这么晚啊？呵呵
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14楼2013-07-19 10:29:20
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
送红花一朵
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15楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-20 00:13:21
一般来说提取基因组是没有必要，但鉴于你这种特殊情况才建议你提取。因为gDNA比质粒大很多，序列自然也复杂很多，所以当你引物对质粒模板特异扩展的时候，并不代表其在质粒和gDNA混合模板中一定是特异扩增。这样做 ...

额，好吧。谢啦谢啦
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16楼2013-07-20 10:55:50
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