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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

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[交流] 酵母转化验证方法已有5人参与

一般质粒转入酵母后，要怎样验证是否成功转入呢？质粒上插入的片段在基因组上也有，而且转入后也以质粒形式存在的。
都要提取质粒的话，工作量确实挺大的。而且我提取质粒后做PCR，虽然有条带，但是条带大小不对啊。。。，有的去测序，结果和基因组上的某个基因是一样的（质粒上的启动子是该基因的），郁闷啊。。。不知道是什么原因

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1楼 2013-07-16 21:12:37

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

Sthunder

木虫 (正式写手)

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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-21 08:03:24

引用回帖:

14楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-07-19 10:29:20
嗯，这两个对照都有的。不过不加载体的不是同时做的，是之前探索抗生素浓度时做的。后来转化的就涂布在不加载体的菌株不生长的浓度下，然后挑的菌。质粒做PCR，不过没有提取基因组呢，这个是必须的吗？谢谢
另 ...

一般来说提取基因组是没有必要，但鉴于你这种特殊情况才建议你提取。因为gDNA比质粒大很多，序列自然也复杂很多，所以当你引物对质粒模板特异扩展的时候，并不代表其在质粒和gDNA混合模板中一定是特异扩增。这样做的目的是检测你质粒中是否存在少量的gDNA污染。当然，做PCR的时候可以顺便做个单引物对照！

PS:我目前在北美，时差原因，而不是我睡得晚哈！

good luck！