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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母转化验证方法
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)

[交流] 酵母转化验证方法 已有5人参与

一般质粒转入酵母后，要怎样验证是否成功转入呢？质粒上插入的片段在基因组上也有，而且转入后也以质粒形式存在的。
都要提取质粒的话，工作量确实挺大的。而且我提取质粒后做PCR，虽然有条带，但是条带大小不对啊。。。，有的去测序，结果和基因组上的某个基因是一样的（质粒上的启动子是该基因的），郁闷啊。。。不知道是什么原因
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1楼 2013-07-16 21:12:37
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肃清华书

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以选择培养基里面进行培养，你提取PCR条带怎么能不对呢。。估计是产物的浓度小了所以提取看不到吧。。
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2楼2013-07-16 21:52:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最靠谱的方法就是把质粒提取出来测序。
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3楼2013-07-16 23:19:00
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 肃清华书 at 2013-07-16 21:52:57
可以选择培养基里面进行培养，你提取PCR条带怎么能不对呢。。估计是产物的浓度小了所以提取看不到吧。。

是在选择培养基上培养的。条带位置确实不对，而且还挺亮的 呢。。。
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4楼2013-07-17 00:13:11
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-07-16 23:19:00
最靠谱的方法就是把质粒提取出来测序。

浓度可能比较低或者什么原因吧，转入大肠都不长
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5楼2013-07-17 00:13:41
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的目的基因在质粒和基因组上都有，有可能在你转化的时候，质粒上的基因与基因组上的基因重组了
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6楼2013-07-17 09:32:46
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 20083630zhan at 2013-07-17 09:32:46
你的目的基因在质粒和基因组上都有，有可能在你转化的时候，质粒上的基因与基因组上的基因重组了

理论上讲，是有这个可能。但是PCR的条带大小及测序结果都说明不是啊，就是基因组上的另一个基因。。。
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7楼2013-07-17 10:04:03
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20083630zhan

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
7楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-07-17 10:04:03
理论上讲，是有这个可能。但是PCR的条带大小及测序结果都说明不是啊，就是基因组上的另一个基因。。。...

你可以分别将基因组和质粒提出来，分别PCR，看看跑胶的条带
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8楼2013-07-17 11:05:43
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heroxuning

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
设计特殊PCR引物，可以避免和基因组的相似片段混淆。
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9楼2013-07-18 09:05:18
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by heroxuning at 2013-07-18 09:05:18
设计特殊PCR引物，可以避免和基因组的相似片段混淆。

做个类似这样的实验，姑且先把质粒上启动子的基因称为A，插入的 目的基因称为B。试着用A的上游引物和B的下游引物做PCR，可是出现了一个更神奇的事情————转入的构建好的载体PCR条带位置正确，但是转入的原有质粒，即未插入B基因的质粒，PCR条带居然和它一样！！！真是百思不得其解。。。。
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10楼2013-07-18 09:46:16
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