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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酵母转化验证方法
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Sthunder

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11楼2013-07-18 11:11:34
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)
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12楼2013-07-18 12:18:19
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Sthunder

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12楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-07-18 12:18:19
插入B基因后，测过序的，结果是对的。转酵母时，没有插入B基因的原载体也做了对照的。你说的阴性对照是指的那种呢？...

如果你的载体构建后通过测序没有问题，那么就肯定没有问题了，现在就检测你的载体是否成功转入。在此，首先你转化的时候记得做阴性对照（1 不加入载体，2 加入空载（该对照对于你将来蛋白表达的时候也是需要的）），然后看你对照1是否生长，如果对照1完全没有长的话，说明你的感受态是没有污染，而且所得转化子相对可信。然后挑克隆（你的实验转化组，和对照2），摇菌，提取质粒和gDNA （记得提个不含任何载体，也就是你的制备感受态菌的gDNA 作为阴性对照），然后进行PCR验证。如果你阴性有条带的话，就换一对特异引物。good luck！
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13楼2013-07-19 01:37:49
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piaoyunokok

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13楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-19 01:37:49
如果你的载体构建后通过测序没有问题，那么就肯定没有问题了，现在就检测你的载体是否成功转入。在此，首先你转化的时候记得做阴性对照（1 不加入载体，2 加入空载（该对照对于你将来蛋白表达的时候也是需要的）） ...

嗯，这两个对照都有的。不过不加载体的不是同时做的，是之前探索抗生素浓度时做的。后来转化的就涂布在不加载体的菌株不生长的浓度下，然后挑的菌。质粒做PCR，不过没有提取基因组呢，这个是必须的吗？谢谢
    另外，你睡觉这么晚啊？呵呵
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14楼2013-07-19 10:29:20
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Sthunder

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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-21 08:03:24
引用回帖:
14楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-07-19 10:29:20
嗯，这两个对照都有的。不过不加载体的不是同时做的，是之前探索抗生素浓度时做的。后来转化的就涂布在不加载体的菌株不生长的浓度下，然后挑的菌。质粒做PCR，不过没有提取基因组呢，这个是必须的吗？谢谢
    另 ...

一般来说提取基因组是没有必要，但鉴于你这种特殊情况才建议你提取。因为gDNA比质粒大很多，序列自然也复杂很多，所以当你引物对质粒模板特异扩展的时候，并不代表其在质粒和gDNA混合模板中一定是特异扩增。这样做的目的是检测你质粒中是否存在少量的gDNA污染。当然，做PCR的时候可以顺便做个单引物对照！

PS:我目前在北美，时差原因，而不是我睡得晚哈！

good luck！
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piaoyunokok
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15楼2013-07-20 00:13:21
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piaoyunokok

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15楼: Originally posted by Sthunder at 2013-07-20 00:13:21
一般来说提取基因组是没有必要，但鉴于你这种特殊情况才建议你提取。因为gDNA比质粒大很多，序列自然也复杂很多，所以当你引物对质粒模板特异扩展的时候，并不代表其在质粒和gDNA混合模板中一定是特异扩增。这样做 ...

额，好吧。谢啦谢啦
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16楼2013-07-20 10:55:50
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