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piaoyunokok

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[交流] 酵母转化验证方法已有5人参与

一般质粒转入酵母后，要怎样验证是否成功转入呢？质粒上插入的片段在基因组上也有，而且转入后也以质粒形式存在的。
都要提取质粒的话，工作量确实挺大的。而且我提取质粒后做PCR，虽然有条带，但是条带大小不对啊。。。，有的去测序，结果和基因组上的某个基因是一样的（质粒上的启动子是该基因的），郁闷啊。。。不知道是什么原因

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1楼 2013-07-16 21:12:37

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Sthunder

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11楼2013-07-18 11:11:34

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引用回帖:

12楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-07-18 12:18:19
插入B基因后，测过序的，结果是对的。转酵母时，没有插入B基因的原载体也做了对照的。你说的阴性对照是指的那种呢？...

如果你的载体构建后通过测序没有问题，那么就肯定没有问题了，现在就检测你的载体是否成功转入。在此，首先你转化的时候记得做阴性对照（1 不加入载体，2 加入空载（该对照对于你将来蛋白表达的时候也是需要的）），然后看你对照1是否生长，如果对照1完全没有长的话，说明你的感受态是没有污染，而且所得转化子相对可信。然后挑克隆（你的实验转化组，和对照2），摇菌，提取质粒和gDNA （记得提个不含任何载体，也就是你的制备感受态菌的gDNA 作为阴性对照），然后进行PCR验证。如果你阴性有条带的话，就换一对特异引物。good luck！

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13楼2013-07-19 01:37:49

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引用回帖:

14楼: Originally posted by piaoyunokok at 2013-07-19 10:29:20
嗯，这两个对照都有的。不过不加载体的不是同时做的，是之前探索抗生素浓度时做的。后来转化的就涂布在不加载体的菌株不生长的浓度下，然后挑的菌。质粒做PCR，不过没有提取基因组呢，这个是必须的吗？谢谢
另 ...

一般来说提取基因组是没有必要，但鉴于你这种特殊情况才建议你提取。因为gDNA比质粒大很多，序列自然也复杂很多，所以当你引物对质粒模板特异扩展的时候，并不代表其在质粒和gDNA混合模板中一定是特异扩增。这样做的目的是检测你质粒中是否存在少量的gDNA污染。当然，做PCR的时候可以顺便做个单引物对照！

PS:我目前在北美，时差原因，而不是我睡得晚哈！

good luck！

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