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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 扩增一个基因
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fanwq258

木虫 (正式写手)

[求助] 扩增一个基因

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/BT017850
链接里的这个基因是blast出来的，但是引物设计了多次了，都没有扩出来，不知道是怎么回事，是不是这段序列本身就是错误的呢？
求高人指点，小弟不胜感激。
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
1楼 2013-07-14 16:33:50
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nxguojunxian

新虫 (初入文坛)

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kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-07-15 20:20:47
1949stone: 回帖置顶 2013-07-16 08:14:11
序列不会是错误的，可能您的序列和链接中的序列有些差异，但一般库里公布的序列是没有问题的，因此建议您从模板，引物，PCR反应体系上找原因：1模板的质量，最好扩增之前跑一下模板，对模板的质量包括浓度和纯度有个大概了解。
2引物设计是否合理，包括GC含量，TM值等，一般GC含量在40-60%，TM在55-65度比较好，2个引物的TM值还不能差异太大，另外还要注意设计引物注意避开发夹结构，二聚体，碱基错配等。
3 PCR体系一般不会有问题，模板质量不好多加一些，质量好稀释少加些。
4 退火温度梯度实验。
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4楼2013-07-15 15:50:52
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bioysy

铜虫 (小有名气)

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1949stone: 回帖置顶 2013-07-16 08:16:53
的确有可能这个品种的DNA这个基因扩不出来,比如这个基因发生了插入/缺失的变异.所以，你可以多拿几个品种试下.另外可能是引物的问题了,重新再多弄几对引物
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独乐乐，不如与众乐
10楼2013-07-16 00:37:21
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fanwq258

木虫 (正式写手)
求解

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
2楼2013-07-15 09:55:01
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wangweida2

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-15 20:20:34
没有产物的可能原因有很多，但是序列本身就是错误的可能性不大。你可以先从提取的模板开始检查，RNA提取质量如何，逆转录效率如何。模板确定没有问题后检查引物，引物设计是否遵循基本原则，方向有没有弄错等等。可能问题一步步解决。
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3楼2013-07-15 14:28:58
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fanwq258

木虫 (正式写手)
1949stone: 建议检测模板质量 可以选择一段不是目的基因 扩增尝试下 再一可以找一些近缘物种基因片段校正你的引物 2013-07-16 08:15:43
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-15 14:28:58
没有产物的可能原因有很多，但是序列本身就是错误的可能性不大。你可以先从提取的模板开始检查，RNA提取质量如何，逆转录效率如何。模板确定没有问题后检查引物，引物设计是否遵循基本原则，方向有没有弄错等等。可 ...

首先，我的模版应该没有问题，因为了、可以扩增出其他基因，引物也是设计了多次，prime5显示质量很好，而且也让其他老师看过，都说引物可以，酶也没有问题，扩其他基因很好用，因此我才说是不是有可能是数据库中的序列有问题呢。唉，愁人
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5楼2013-07-15 16:44:31
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fanwq258

木虫 (正式写手)
1949stone: 数据库里的基因一般不会有问题 这可是发表文章里引用的 你可以给作者邮件 沟通一下 2013-07-16 08:16:42
引用回帖:
4楼: Originally posted by nxguojunxian at 2013-07-15 15:50:52
序列不会是错误的，可能您的序列和链接中的序列有些差异，但一般库里公布的序列是没有问题的，因此建议您从模板，引物，PCR反应体系上找原因：1模板的质量，最好扩增之前跑一下模板，对模板的质量包括浓度和纯度有个 ...

首先，我的模版应该没有问题，因为了、可以扩增出其他基因，引物也是设计了多次，prime5显示质量很好，而且也让其他老师看过，都说引物可以，pcr退火温度也是反复试了好多次，都没有结果。酶也没有问题，扩其他基因很好用，因此我才说是不是有可能是数据库中的序列有问题呢。
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6楼2013-07-15 16:46:23
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wangweida2

新虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-19 00:45:42
引用回帖:
5楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-07-15 16:44:31
首先，我的模版应该没有问题，因为了、可以扩增出其他基因，引物也是设计了多次，prime5显示质量很好，而且也让其他老师看过，都说引物可以，酶也没有问题，扩其他基因很好用，因此我才说是不是有可能是数据库中的 ...

正常情况下是不会怀疑NCBI上的序列有错误的。貌似能想到的可能原因也都想差不多了。有没有这种可能性，你提取的样本中没有这个基因，或者这个基因没有表达。
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7楼2013-07-15 17:19:22
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fanwq258

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by wangweida2 at 2013-07-15 17:19:22
正常情况下是不会怀疑NCBI上的序列有错误的。貌似能想到的可能原因也都想差不多了。有没有这种可能性，你提取的样本中没有这个基因，或者这个基因没有表达。...

这个基因我是通过拟南芥的该基因序列blast出来的，拟南芥中这个基因是研究的挺热的一个基因，因此我想研究玉米中该基因的功能，可是，现在第一步就卡住了，
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要么好好活，要么死，拒绝半死不活
8楼2013-07-15 17:32:52
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nxguojunxian

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:
6楼: Originally posted by fanwq258 at 2013-07-15 16:46:23
首先，我的模版应该没有问题，因为了、可以扩增出其他基因，引物也是设计了多次，prime5显示质量很好，而且也让其他老师看过，都说引物可以，pcr退火温度也是反复试了好多次，都没有结果。酶也没有问题，扩其他基因 ...

找一下此基因相应的参考文献吧，看看那里边有没有具体的引物序列和PCR反应体系拿来试试
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9楼2013-07-15 22:06:04
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