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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切后转化
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Pushing2012

金虫 (正式写手)

[求助] 双酶切后转化

本人将载体pet28（5400bp左右）和目的基因（1000bp）做双酶切(bamH1, Not1）后，连接，然后转化，每次平板上都长一大堆菌落出来，反复挑了24个单克隆，一个都没有装进目的基因的，而且电泳检测发现单克隆中提取的质粒大小仅有3000-4000bp. 将酶切产物检测发现质粒酶切后出现3条带以上，这个酶切后出现多条带shi怎么回事？还有为啥没有阳性克隆出现，而且比空载体还小？我都要崩溃了，请各位大虾帮帮忙。
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1楼 2013-06-14 17:11:48
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我的第一印象是转化了污染的菌或者是质粒.
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2楼2013-06-14 18:26:03
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Pushing2012: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-06-18 14:08:52
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-26 21:50:31
一般来说，克隆是出现大量的背景克隆的主要原因就是载体的酶切处理出了问题。
建议：
1）首先，建议进行单酶切分析，看看在你的酶切条件下，单酶切是否彻底。
2）设置空载体的连接反应对照，以进一步分析双酶切是否彻底。
更具体的操作方案，可以参见http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html

其实，将量化的概念引入到分子克隆中，实验就相对可控了。
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3楼2013-06-14 22:13:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-26 21:50:39
转化子提质粒直接跑电泳不太好直接估计分子量，最好做单酶切成线状后再与marker比，同时你可以切一个空载体作为对照，很容易通过比较看出是否连入1kb的片段。
酶切出现多条带可能是酶切不完全造成的。你最好跑一个质粒做对照。

我觉得你先确定一下转化子的质粒大小，跑到3000-4000的超螺旋质粒的实际大小一般要比这大得多。你说的这个范围太广又没有图，不好判断是否连进去了。简单的做法是跑一个空载体质粒与之比较。如果看不出来可以分别做单酶切成线状分子后比较。酶切时注意根据质粒的量加酶。
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4楼2013-06-15 03:27:09
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议楼主：1、连接前先对质粒及目的基因测测浓度，浓度过低不宜做转化；2、转化进行蓝白斑筛选，用空质粒（未连接目的片段）作对照，挑出白斑；3、提单克隆质粒用单酶切成线性状作对照。祝楼主成功。
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要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
5楼2013-06-15 10:44:49
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
楼主楼主，看过来，我和你一样的，你找到原因没啊，我的连接酶，水，buffer全是新的，胶神马全是新的，和你一样的啊，一模一样，我还没解决问题的，你找到原因没？
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6楼2013-06-26 20:14:47
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ivyvampire

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-06-14 22:13:38
一般来说，克隆是出现大量的背景克隆的主要原因就是载体的酶切处理出了问题。
建议：
1）首先，建议进行单酶切分析，看看在你的酶切条件下，单酶切是否彻底。
2）设置空载体的连接反应对照，以进一步分析双酶切是 ...

专家你好，载体对照，意思是要加连接酶吗？我设了个没加酶的，看来可以添加一步呀？求指导
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7楼2013-06-26 20:17:23
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

连接转化的时候一定要定量，。载体和插入片段mol比为1：10。。。16度过夜。。涂板的时候少涂一点。。。不要让长出微型菌落。。祝好
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8楼2013-06-26 21:20:12
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