| 查看: 1259 | 回复: 7 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
Pushing2012金虫 (正式写手)
|
[求助]
双酶切后转化
|
|
| 本人将载体pet28（5400bp左右）和目的基因（1000bp）做双酶切(bamH1, Not1）后，连接，然后转化，每次平板上都长一大堆菌落出来，反复挑了24个单克隆，一个都没有装进目的基因的，而且电泳检测发现单克隆中提取的质粒大小仅有3000-4000bp. 将酶切产物检测发现质粒酶切后出现3条带以上，这个酶切后出现多条带shi怎么回事？还有为啥没有阳性克隆出现，而且比空载体还小？我都要崩溃了，请各位大虾帮帮忙。 |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有267人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有15人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
已经有23人回复
- 双酶切后切胶回收
已经有34人回复
- 连接检测时双酶切总是切不开
已经有9人回复
- 双酶切后目的条带很淡，回收不到
已经有15人回复
- 双酶切之后，线状质粒的连接问题
已经有13人回复
- 空质粒双酶切后大小不对，纠结！
已经有11人回复
- 酶切酶连转化后单克隆检测不对
已经有8人回复
- 双酶切后目的条带的疑问？
已经有8人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- 连接产物双酶切
已经有11人回复
- 求助关于双酶切空载跑胶没有条带！
已经有15人回复
- （侯氏出品）双酶切连接反应之全攻略
已经有89人回复
- 双酶切，连接，转化问题
已经有30人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 本人做了双酶切连接转化，真的真的有想死的心了
已经有6人回复
- 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
已经有13人回复
- 双酶切，体系，切不出来
已经有10人回复
- 双酶切的片段不见了？
已经有6人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】双酶切载体总是切不完全
已经有11人回复
- 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
已经有12人回复
sunnyboylg
木虫 (正式写手)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 3020.2
- 红花: 4
- 帖子: 469
- 在线: 110.3小时
- 虫号: 2348227
- 注册: 2013-03-15
- 性别: GG
- 专业: 植物病理学
5楼2013-06-15 10:44:49
bullfrog325
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 1
- 应助: 193 (高中生)
- 金币: 2880.3
- 散金: 200
- 红花: 24
- 帖子: 744
- 在线: 269.5小时
- 虫号: 1864929
- 注册: 2012-06-20
2楼2013-06-14 18:26:03
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Pushing2012: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-06-18 14:08:52
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-26 21:50:31
感谢参与，应助指数 +1
Pushing2012: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-06-18 14:08:52
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-26 21:50:31
|
一般来说，克隆是出现大量的背景克隆的主要原因就是载体的酶切处理出了问题。 建议： 1）首先，建议进行单酶切分析，看看在你的酶切条件下，单酶切是否彻底。 2）设置空载体的连接反应对照，以进一步分析双酶切是否彻底。 更具体的操作方案，可以参见http://wenku.baidu.com/view/1b0ea0d608a1284ac85043ef.html 其实，将量化的概念引入到分子克隆中，实验就相对可控了。 |
3楼2013-06-14 22:13:38
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-26 21:50:39
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-26 21:50:39
|
转化子提质粒直接跑电泳不太好直接估计分子量，最好做单酶切成线状后再与marker比，同时你可以切一个空载体作为对照，很容易通过比较看出是否连入1kb的片段。 酶切出现多条带可能是酶切不完全造成的。你最好跑一个质粒做对照。 我觉得你先确定一下转化子的质粒大小，跑到3000-4000的超螺旋质粒的实际大小一般要比这大得多。你说的这个范围太广又没有图，不好判断是否连进去了。简单的做法是跑一个空载体质粒与之比较。如果看不出来可以分别做单酶切成线状分子后比较。酶切时注意根据质粒的量加酶。 |
4楼2013-06-15 03:27:09
