24小时热门版块排行榜    

查看: 1005  |  回复: 7

周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒构建问题

最近在做一个基因的表达构建,采用实验室师兄连有外源片段的质粒,双酶切作载体,从大肠基因组上通过PCR拿到的片段进行双酶切,然后T4连接,挑出来的转化子居然是师兄连有外源片段的质粒,这是什么情况?是没有酶切完全吗?可是对载体进行切胶回收的时候,跑了2个半小时,应该分得很开了
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:35
有可能是没有切开,不知道你挑的转化子是否都是假阳性?不过建议楼主连接后跑胶看看连接后质粒的大小和浓度。
2楼2013-05-21 10:12:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:42
应该是没切开,假阳性的问题,你挑转化子可以多挑几个试试
3楼2013-05-21 10:46:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
周志惠: 金币+5, 有帮助, 切两个半小时,还没有够吗 2013-05-21 10:52:47
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:52
应该是没有切开啊,建议你在切胶回收前做下电泳验证下
天才就怕不够天才,坏又不够坏,天天都想离开,却不知何处才能换骨脱胎
4楼2013-05-21 10:46:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:16:25
gyesang: 回帖置顶 2013-05-23 22:16:28
肯定胶回收的时候还是带着没切开的质粒了,质粒转化效率比连接产物高太多,所以有一点点污染,拿到的转化子也大都是质粒的。不知道你师兄的外源片段是多大的,建议再说双酶切是质粒切得少一点,浓度太高切不彻底和跑胶分不开的问题。你也应该再多几个转化子检测一下。
5楼2013-05-21 12:33:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

my_father

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:16:37
载体过夜酶切比较保险,时间也好安排。
另外不知道你的这个双酶切有没有用到XbaI,这个酶切位点紧挨着后面是个T的话会甲基化,切不动。
6楼2013-05-21 15:08:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验! 2013-05-23 22:16:46
酶切2.5小时其实不太够,我一般都切过夜的
天才就怕不够天才,坏又不够坏,天天都想离开,却不知何处才能换骨脱胎
7楼2013-05-22 15:26:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

周志惠

新虫 (小有名气)

问题解决了,应该是感受态细胞的问题,谢谢大家了哦
8楼2013-05-23 16:04:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 周志惠 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 大佬帮着分析今年的评审意见?该课题连续申请了三年了,明年要不要换个方向。 100+3 cai-11138 2026-08-31 10/500 2026-09-06 19:40 by babero
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 19:21 by eObJPa4gWmp6
[博后之家] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 6/300 2026-09-06 18:41 by eObJPa4gWmp6
[硕博家园] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 6/300 2026-09-06 18:21 by eObJPa4gWmp6
[论文投稿] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 6/300 2026-09-06 18:01 by eObJPa4gWmp6
[找工作] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 8/400 2026-09-06 17:49 by eObJPa4gWmp6
[教师之家] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 9/450 2026-09-06 17:09 by eObJPa4gWmp6
[考研] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-04 8/400 2026-09-06 17:09 by eObJPa4gWmp6
[教师之家] 售SCI一区T0P文章,我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 13:09 by eObJPa4gWmp6
[考博] 售SCI一区文章,我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 3/150 2026-09-06 12:49 by eObJPa4gWmp6
[考博] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 j5mmowWXNWxv 2026-09-05 4/200 2026-09-06 12:29 by eObJPa4gWmp6
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题,而不是去凝练问题 +10 瞬息宇宙 2026-09-01 19/950 2026-09-06 11:15 by jiangxuan2004
[论文投稿] 售SCI-T0P文章,我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-04 8/400 2026-09-06 11:00 by eObJPa4gWmp6
[考研] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 jPDp0sc2B7zQ 2026-09-05 4/200 2026-09-06 07:20 by E1iiBLMU2XnD
[基金申请] 面上没中,邀请各位路过的虫友分析一下分数 +12 jackleilei 2026-09-03 13/650 2026-09-05 18:10 by fireguard
[文学芳草园] 初秋的晨风 +4 阿美_Lml888 2026-09-04 6/300 2026-09-05 13:51 by 阿美_Lml888
[硕博家园] Ei源刊怎么投 +4 Fengshun9711 2026-09-04 4/200 2026-09-04 19:30 by 研途知予
[硕博家园] 哈尔滨工业大学韩晓军教授课题组招收2027年硕士推免生及博士研究生 +3 灯灯灯灯DDDD 2026-09-03 3/150 2026-09-03 21:22 by 科研皮皮猪
[基金申请] 要骂人了,新模版改版就是要淡化问题凝练这种虚的东西,结果有个评委还在说凝练得不够 +9 瞬息宇宙 2026-08-31 17/850 2026-09-02 14:04 by anjeeshine
信息提示
请填处理意见