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周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒构建问题

最近在做一个基因的表达构建,采用实验室师兄连有外源片段的质粒,双酶切作载体,从大肠基因组上通过PCR拿到的片段进行双酶切,然后T4连接,挑出来的转化子居然是师兄连有外源片段的质粒,这是什么情况?是没有酶切完全吗?可是对载体进行切胶回收的时候,跑了2个半小时,应该分得很开了
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my_father

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:16:37
载体过夜酶切比较保险,时间也好安排。
另外不知道你的这个双酶切有没有用到XbaI,这个酶切位点紧挨着后面是个T的话会甲基化,切不动。
6楼2013-05-21 15:08:17
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:35
有可能是没有切开,不知道你挑的转化子是否都是假阳性?不过建议楼主连接后跑胶看看连接后质粒的大小和浓度。
2楼2013-05-21 10:12:41
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:42
应该是没切开,假阳性的问题,你挑转化子可以多挑几个试试
3楼2013-05-21 10:46:12
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youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
周志惠: 金币+5, 有帮助, 切两个半小时,还没有够吗 2013-05-21 10:52:47
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:52
应该是没有切开啊,建议你在切胶回收前做下电泳验证下
天才就怕不够天才,坏又不够坏,天天都想离开,却不知何处才能换骨脱胎
4楼2013-05-21 10:46:51
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