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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒构建问题
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周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒构建问题

最近在做一个基因的表达构建，采用实验室师兄连有外源片段的质粒，双酶切作载体，从大肠基因组上通过PCR拿到的片段进行双酶切，然后T4连接，挑出来的转化子居然是师兄连有外源片段的质粒，这是什么情况？是没有酶切完全吗？可是对载体进行切胶回收的时候，跑了2个半小时，应该分得很开了
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1楼 2013-05-21 10:05:12
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qqxs

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:16:25
gyesang: 回帖置顶 2013-05-23 22:16:28
肯定胶回收的时候还是带着没切开的质粒了，质粒转化效率比连接产物高太多，所以有一点点污染，拿到的转化子也大都是质粒的。不知道你师兄的外源片段是多大的，建议再说双酶切是质粒切得少一点，浓度太高切不彻底和跑胶分不开的问题。你也应该再多几个转化子检测一下。
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5楼2013-05-21 12:33:40
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:15:35
有可能是没有切开，不知道你挑的转化子是否都是假阳性？不过建议楼主连接后跑胶看看连接后质粒的大小和浓度。
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2楼2013-05-21 10:12:41
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:15:42
应该是没切开，假阳性的问题，你挑转化子可以多挑几个试试
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3楼2013-05-21 10:46:12
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youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
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周志惠: 金币+5, ★有帮助, 切两个半小时，还没有够吗 2013-05-21 10:52:47
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:15:52
应该是没有切开啊，建议你在切胶回收前做下电泳验证下
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天才就怕不够天才，坏又不够坏，天天都想离开，却不知何处才能换骨脱胎
4楼2013-05-21 10:46:51
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my_father

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-23 22:16:37
载体过夜酶切比较保险，时间也好安排。
另外不知道你的这个双酶切有没有用到XbaI，这个酶切位点紧挨着后面是个T的话会甲基化，切不动。
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6楼2013-05-21 15:08:17
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youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-23 22:16:46
酶切2.5小时其实不太够，我一般都切过夜的
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天才就怕不够天才，坏又不够坏，天天都想离开，却不知何处才能换骨脱胎
7楼2013-05-22 15:26:44
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周志惠

新虫 (小有名气)
问题解决了，应该是感受态细胞的问题，谢谢大家了哦
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8楼2013-05-23 16:04:42
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