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周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 质粒构建问题

最近在做一个基因的表达构建,采用实验室师兄连有外源片段的质粒,双酶切作载体,从大肠基因组上通过PCR拿到的片段进行双酶切,然后T4连接,挑出来的转化子居然是师兄连有外源片段的质粒,这是什么情况?是没有酶切完全吗?可是对载体进行切胶回收的时候,跑了2个半小时,应该分得很开了
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qqxs

木虫 (正式写手)

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★ ★
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周志惠(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:16:25
gyesang: 回帖置顶 2013-05-23 22:16:28
肯定胶回收的时候还是带着没切开的质粒了,质粒转化效率比连接产物高太多,所以有一点点污染,拿到的转化子也大都是质粒的。不知道你师兄的外源片段是多大的,建议再说双酶切是质粒切得少一点,浓度太高切不彻底和跑胶分不开的问题。你也应该再多几个转化子检测一下。
5楼2013-05-21 12:33:40
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


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周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:35
有可能是没有切开,不知道你挑的转化子是否都是假阳性?不过建议楼主连接后跑胶看看连接后质粒的大小和浓度。
2楼2013-05-21 10:12:41
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ericyo918

至尊木虫 (知名作家)

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周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:42
应该是没切开,假阳性的问题,你挑转化子可以多挑几个试试
3楼2013-05-21 10:46:12
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youngker918

金虫 (正式写手)

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周志惠: 金币+5, 有帮助, 切两个半小时,还没有够吗 2013-05-21 10:52:47
周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:15:52
应该是没有切开啊,建议你在切胶回收前做下电泳验证下
天才就怕不够天才,坏又不够坏,天天都想离开,却不知何处才能换骨脱胎
4楼2013-05-21 10:46:51
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my_father

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


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周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-23 22:16:37
载体过夜酶切比较保险,时间也好安排。
另外不知道你的这个双酶切有没有用到XbaI,这个酶切位点紧挨着后面是个T的话会甲基化,切不动。
6楼2013-05-21 15:08:17
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youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


周志惠(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验! 2013-05-23 22:16:46
酶切2.5小时其实不太够,我一般都切过夜的
天才就怕不够天才,坏又不够坏,天天都想离开,却不知何处才能换骨脱胎
7楼2013-05-22 15:26:44
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周志惠

新虫 (小有名气)

问题解决了,应该是感受态细胞的问题,谢谢大家了哦
8楼2013-05-23 16:04:42
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