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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR扩增 水稻未知基因 反转录
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xiaowoodworm

金虫 (正式写手)

[求助] PCR扩增 水稻未知基因 反转录

水稻 ，一段未知功能的序列 2.8K长 cDNA 用ACTIN检测 质量较好 引物 是头尾个20bp 加上酶切位点NHEI 和 BGLII和保护碱基 用的Takara的PRIMERSTAR GXL 和takara的普通酶 完全扩不出来  换成DNA 还是扩不出来 。请问各位大神是什么原因，解决方法？
     还有个问题 拉 某一段2.8K 已知cDNA的全长, 用一般的反转试剂盒是不是可以 还是一定要用RACE吗？求各位能给予帮助！谢谢啦！
    以下附图：
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1楼 2013-04-01 19:26:06
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xiaowoodworm

金虫 (正式写手)
刚才不会上传图片，现附上图片。请各位师兄师姐帮帮忙！

333.jpg
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2楼2013-04-02 16:23:36
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xiaowoodworm

金虫 (正式写手)
刚才稍调整了下图片。现在再次上传图片。

333.jpg
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3楼2013-04-02 16:29:09
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gyesang

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【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
xiaowoodworm(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-11 08:22:09
你这种情况，需要优化下引物，不一定要先加上酶切位点，你可以先将包含有你基因ORF的cDNA扩出来，构建到T载体等中间载体上，再设计引物扩CDS做表达或者其他用途，所以我的建议是重新设计引物，引物可以设计在你基因的5‘和3’UTR里面
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2013-04-02 19:40:26
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xiaowoodworm

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-02 19:40:26
你这种情况，需要优化下引物，不一定要先加上酶切位点，你可以先将包含有你基因ORF的cDNA扩出来，构建到T载体等中间载体上，再设计引物扩CDS做表达或者其他用途，所以我的建议是重新设计引物，引物可以设计在你基因 ...

谢谢gyesang你,再请教下：1，可是这是一段未知功能的基因， NCBI上只有单纯的 CDS 没有UTR？2，CDNA的质量和这个有没有关系？
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5楼2013-04-02 21:57:14
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gyesang

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优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by xiaowoodworm at 2013-04-02 21:57:14
谢谢gyesang你,再请教下：1，可是这是一段未知功能的基因， NCBI上只有单纯的 CDS 没有UTR？2，CDNA的质量和这个有没有关系？...

如果只有CDS序列，那的确，引物就不好优化了

cDNA的质量当然是有很大关系的，要保证cDNA的质量，就要在mRNA的质量上严加控制
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
6楼2013-04-03 01:02:37
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xiaowoodworm

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by gyesang at 2013-04-03 01:02:37
如果只有CDS序列，那的确，引物就不好优化了

cDNA的质量当然是有很大关系的，要保证cDNA的质量，就要在mRNA的质量上严加控制...

谢谢啦！
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7楼2013-04-10 21:19:18
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