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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取总DNA出现RNA污染，会不会影响后续PCR及测序问题
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lwzy888

金虫 (小有名气)

[求助] 提取总DNA出现RNA污染，会不会影响后续PCR及测序问题

我做细菌群落分析，在用试剂盒提取根瘤的总DNA的时候，发现底部有RNA污染，如果不除去RNA,会不会影响后续的16SrDNA的PCR以及建文库和测序什么的？谁能给点指示？
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1楼 2013-08-17 16:57:57
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回帖置顶 ( 共有1个 )

lwzy888

金虫 (小有名气)
amisking: 回帖置顶 2013-08-17 21:08:20
引用回帖:
5楼: Originally posted by oylb at 2013-08-17 19:02:31
理论上在操作过程中加入RNase最好，但是提取成功之后有点RNA污染也很正常。

这种情况下就需要在溶解的DNA里面加入RNase处理，然后酚/氯仿处理、氯仿处理、乙醇沉淀等步骤进行回收纯化。...

我是这么想的：我构建16SrDNA克隆文库，而且16SrDNA 批出来后大约500bp,RNA 肯定不在这个区域，我可以直接胶回收就OK啦，是不是这样子？
另外，提总DNA我是用试剂盒提的，那么在提出的DNA里加入酶之后怎么回收纯化呢？继续用纯化试剂盒吗？
再次感谢！
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7楼2013-08-17 20:56:22
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普通回帖

aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
★ ★
amisking: 金币+2, 感谢发帖应助，帮助虫子 2013-08-17 21:08:15
不知道会不会对测序有影响，但是楼主你可以加RNase A （DNase free）来除去RNA，一般20ul的体系加1ul酶和4ul超纯水就够了，室温或者37度水浴半小时即可。不放心的话再跑一个胶看一下降解结果。
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2楼2013-08-17 18:19:44
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lwzy888

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by aaa0001984 at 2013-08-17 18:19:44
不知道会不会对测序有影响，但是楼主你可以加RNase A （DNase free）来除去RNA，一般20ul的体系加1ul酶和4ul超纯水就够了，室温或者37度水浴半小时即可。不放心的话再跑一个胶看一下降解结果。

是提出来的DNA里面再加RNase A 酶吗？我提取的过程中按说明书加了的，然后室温静置了15分钟。
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3楼2013-08-17 18:48:03
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oylb

禁言 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lwzy888: 金币+50, ★★★很有帮助, 非常感谢！ 2013-08-17 20:51:22
本帖内容被屏蔽
4楼2013-08-17 18:59:30
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oylb

禁言 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
5楼2013-08-17 19:02:31
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aaa0001984

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lwzy888 at 2013-08-17 18:48:03
是提出来的DNA里面再加RNase A 酶吗？我提取的过程中按说明书加了的，然后室温静置了15分钟。...

恩，是的。提出DNA，超纯水溶解后加点RNase A
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6楼2013-08-17 19:02:58
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oylb

禁言 (正式写手)
本帖内容被屏蔽

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lwzy888
8楼2013-08-18 11:06:03
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lwzy888

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by oylb at 2013-08-18 11:06:03
DNA直接做文库，最好去除RNA；PCR产物做文库的话，将DNA片段切胶回收就可以了，不需要做后续的RNase处理（清除RNA和RNase）等繁琐步骤。

你是用16SrDNA作为标记，分析环境微生物的多态性？如果是的话，需要在PC ...

是的，我是用的RFLP分析多样性的，现在还只是DNA-PCR阶段...
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9楼2013-08-18 14:44:35
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